耐盐复合菌剂强化生物工艺处理高盐废水的快速启动

摘要：从城市污水处理厂的活性污泥中驯化分离出2 株耐盐高效菌：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ）O1 和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Y5 制备复合菌剂，用于高盐生活污水生物处理工艺快速启动研究｡研究表明，在SBR 系统中连续投加复合菌剂（制备的配比为1 ∶ 1），在30 d 完成快速启动（TOC 去除率> 85%），并且在整个启动过程中，TOC 的去除率都能够稳定保持在80%左右，而负载复合菌剂填料的投入可获得更稳定的出水水质｡通过高通量测序与OTU 分类，高盐废水的配入使得活性污泥微生物群落结构发生显著改变，并且在工艺启动后，所投加的耐盐高效菌O1 和Y5 在活性污泥微生物总量中所占比例由1. 31%升高至6. 13%，说明O1 和Y5 能够在小试SBR 中长期存留，并逐渐成为优势种属之一｡

关键词：高盐废水；耐盐复合菌剂；快速启动；高通量测序；微生物群落结构

高盐废水是指总含盐（如Na +､K +､Cl - 和SO2 -4等）质量分数≥1%的废水[1-2]｡近年来一些沿海城市积极开展海水的直接利用（如海水用于冲厕､冲洗道路､消防以及工业冷却水等），预计到2020 年，全国海水直接利用量将达到1 × 109 m3·a - 1[3]，海水直接利用量的快速增长是导致高盐废水大量排放的一个重要原因｡目前，高盐废水最主要的处理方式是通过市政管网进入城市污水处理系统｡高盐废水通常包含Na +､K +､Cl - 和SO2 -4等盐类物质，这些离子浓度过高，会快速增大细胞渗透压从而破坏菌体细胞，同时产生盐析作用降低脱氢酶活性抑制细菌生长，而且高浓度的氯离子对细菌有一定地毒害作用[1-2]｡因此，高盐废水会对传统污水生物处理工艺产生明显的抑制作用[4]，特别是在生物处理工艺的启动期，活性污泥受到抑制会导致工艺出水水质恶化，COD 和SS 浓度剧增｡生物工艺处理高盐废水的最大问题在于微生物的代谢功能遭到破坏，原后生动物数量剧减，污泥驯化缓慢，反应器启动时间较长[5-7]｡常丽丽等[8]研究了含盐废水生化处理耐盐污泥驯化，发现驯化初期城市污水处理厂的污泥对含盐废水中COD 的去除率仅为30% ~ 40%，经过80 d 的驯化后COD 去除率才能达到90%｡宋晶等[7]直接驯化嗜盐菌处理高盐废水，采用序批式生物膜法（sequencing batch biofilm reactor，SBBR），通过逐步提高盐度的方法模拟高盐废水的处理，出水COD 能够达到90% 以上，但嗜盐菌的驯化与扩培缓慢导致SBBR 很难快速启动[7]｡HAMODA 等[9]研究发现高盐环境并未完全抑制微生物生长，相反会促进一些嗜盐细菌的生长；KARGI等[11-12]发现通过投加嗜盐微生物能够加速微生物群落结构的演替，从而缩短污泥驯化的过程｡通过投加复合菌剂进行生物强化成为了高盐废水处理研究的热点｡张波等[13]制备复合嗜盐菌剂强化处理高盐有机废水，中试实验结果表明，投加复合嗜盐菌剂能够加快厌氧反应器的启动，在70 d 内就完成了启动过程，且复合菌剂能够有效改善生化系统对TOC 的去除效果，对TOC 的去除率由投菌前的50%左右提高至70%以上｡大多数研究仅通过污染物去除效率来描述生物强化的效果，复合菌剂对活性污泥微生物群落机构演替的作用以及其能否在反应器中长期存留，均需要进一步研究与探讨｡

本研究依靠投加外源耐盐高效复合菌剂，改善生物处理工艺启动期处理效果，实现高盐废水生物处理工艺的快速启动｡采用分子生物学的方法分析启动与完成阶段活性污泥生物群落结构的变化，考察耐盐高效复合菌剂在反应体系内的存留时间，为开发高盐废水生物处理工艺提供技术支持｡

1 实验部分

1. 1 耐盐高效菌与复合菌剂制备

耐盐高效菌：本研究采用的耐盐菌是由本实验室筛选获得的耐盐高效菌O1 和Y5[14]；地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis） O1 和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） Y5 均可降解高盐废水中的有机物，具有耐盐､适用pH 值范围宽､适用温度范围宽的特点[14]｡

LB 液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 50 g，Milli-Q 水1 000 mL；LB 固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 50 g，琼脂15 g，Milli-Q 水1 000 mL；在LB 液体和固体培养基中分别加入45 g 和65 g的NaCl，配置含盐量5%和7%的高盐LB 培养基，用于复合菌剂的制备与扩培｡

亲水性聚氨酯生物填料：密度约为23 kg·m - 3，孔径为2 ~ 3 mm，孔隙率> 90%，比表面积23. 3 × 103m2·kg - 1，微生物负载量16 ~ 20 kg·m - 3｡

复合菌剂的制备：将已经筛选获得的耐盐高效菌O1 和Y5 分别接种到盐度为5%和7%的LB 液体培养基中，在25 ℃､150 r·min - 1的条件下培养，每隔2 h 测定OD600，当菌株Y1 和Q5 的OD600值分别达到3. 10 和1. 39 时，由画线法可测得LB 液体培养基中的菌浓度达到107 CFU·mL - 1｡将分别含有2 株菌的LB 液体培养基按1∶ 1 体积比混合[14]，离心并撇除上清液，加入PBS 缓冲液冲洗3 次，其菌含量约为1 gMLVSS·L - 1｡

复合菌剂的负载：将分别含有2 株菌的LB 液体培养基按1 ∶ 1 体积比混合，同时加入边长为1 cm 的聚氨酯立方体1 g，在25 ℃，150 r·min - 1 的条件下培养12 h 即完成了复合菌剂的固定化，取出聚氨酯立方体，用PBS 缓冲液冲洗3 次，其负载量约为0. 8 g MLVSS·g - 1｡

1. 2 实验装置及运行

实验采用的SBR 装置（ 见图1） 呈圆柱体，由有机玻璃制成，有效高度为70 cm，内径为19 cm，有效容积为5 L；反应器底部设有微孔砂盘曝气器，曝气量由转子流量计调节；反应器上方设有搅拌器；反应器进水､出水､曝气及搅拌均通过时控开关自动完成，而排泥则通过手动完成｡

3 个平行运行的SBR 中R1 和R2 作为实验组，分别投加复合菌剂和负载复合菌剂的填料进行生物强化，R3 作为对照组只保持相同生物量的活性污泥｡3 个SBR 的水力停留时间（HRT） 均为12 h，排水比为1 /2，其中每个循环6 h，包括进水0. 5 h，缺氧反应1 h，好氧反应3 h，排水0. 5 h 以及闲置0. 5 h｡污泥浓度（MLSS） 控制在3 500 ~ 5 500 mg·L - 1，好氧反应末端溶解氧（DO）控制在6 ~ 8 mg·L - 1，温度为25 ~ 28 ℃｡

1. 3 接种污泥与实验用水

实验所用活性污泥取自市政污水处理厂的二沉池｡实验用水取自生态环境研究中心家属区生活污水，投加粗盐配成盐度为3% ~ 5% 的高盐生活污水，原生活污水常规水质指标见表1｡

1. 4 DNA 提取及群落结构分析

DNA 提取与PCR 扩增：4 mL 污泥样品10 000 r·min - 1离心10 min｡使用Fast DNA SPIN for Soil 试剂盒（MP Biomedical，France）按提取说明操作｡提取的DNA 在Nano 分光光度计（Nano，USA）上测定DNA 的浓度和质量，并使用1%琼脂糖凝胶电泳验证DNA 的完整性｡采用PCR 对16S rRNA 的V4 区进行扩增，引物为515F（5’-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’）和907R（5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’），反应条件为95 ℃预变性2 min；之后95 ℃变性30 s､55 ℃退火30 s､72 ℃延伸30 s 共循环25 次；最后72 ℃保持5 min｡PCR 反应体系为20 μL，包括4 μL 5 × FastPfu Buffer､2 μL 2. 5 mmol·L - 1 dNTPs､0. 8μL 上下游引物（5 μmol·L - 1）､0. 4 μL FastPfu 聚合酶和10 μg DNA 模板｡

高通量测序与OTU 分类：采用Illumina Miseq 平台（Illumina，USA）测序分析，测序数据经优化后，每个样品含有28577 条有效序列｡有效序列采用Ribosomal Database Project （RDP） 分类｡Circos 图采用Circos 软件（ http：/ /mkweb. bcgsc. ca /tableviewer /） 绘制；主成分分析（PCA） 采用Canoco 5. 0 绘制（Microcomputer，USA）；热图（Heatmap）采用Hemi 1. 0（http：/ /hemi. biocuckoo. org /）PCA 和热图是基于前含量前10 位菌属绘制｡

1. 5 水质分析项目及方法

TOC：element 元素分析仪测定；DO：YSI550A 溶氧仪测定；pH：SartoriusPB-20 pH 计测定；TDS､MLSS､MLVSS：重量法｡

2 结果与讨论

2. 1 复合菌剂投加量优化

采用250 mL 摇瓶实验考察不同复合菌剂投加量的SBR 对TOC 的降解效果，从而实现复合菌剂投加量优化｡培养条件：转速为150 r·min - 1，25 ℃；将活性污泥接种于摇瓶中，接种量为2 040 g MLVSS·L - 1；采用批次换水，停留时间8 h｡48 h 后出水的TDS 基本稳定，按表2 方法投加复合菌剂，并且停止换水｡取样周期为2 h，连续采样24 h｡样品离心并过0. 45 μm 滤膜，测定TOC 值｡

由图2 可知，随着复合菌剂投加量的增加，投加复合菌剂的生物强化系统（ bio-augmentation system，BS）的TOC 降解速度逐渐加快，最大降解率也有所增强｡投加1%､5%､10% 和15% 复合菌的由于投菌量由10%增加到15%，TOC 去除速率与最大去除率均没有显著提高，说明投菌量增加到一定程度后，对系统降解速度和降解效果影响变化不大[11，15]，所以反应器运行选择10%投菌量｡