晚期垃圾渗滤液MBR亚硝化系统中细菌及功能菌的多样性

1.2.2聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增

以提取的DNA作为模板,分别进行通用克隆文库和AOB克隆文库的PCR扩增，PCR扩增中所采用的引物、扩增体系以及反应条件如表2所示.

表2克隆文库中PCR扩增条件

PCR反应在MyiQReal-timePCR扩增仪(美国,Bio-Rad)上进行.扩增时做空白对照,对照组除不加DNA模板外,其他实验组分与实验组相同.反应结束后,取5μLPCR产物跑胶验证目的基因片段长度是否正确.

1.2.3克隆、转化和16SrDNA克隆文库的构建

采用DNA胶回收试剂盒(上海生工)将PCR产物进行切胶纯化,将纯化后产物与pMD18-T载体(Takara)连接,连接体系(10μL):PCR产物,3μL;pMD18-TVector,1μL;SolutionI,5μL;灭菌超纯水,1μL.将连接液混合均匀,在16℃条件下反应4h后将连接液全部转入EcoliDH5α感受态细胞(Takara，Japan)中.将混合液涂布在含Amp/X-Gal/IPTG的LB固体培养基上,37℃条件下培养16~24h后进行阳性克隆子筛选.其中，白斑为具有氨苄青霉素抗性的阳性菌落,蓝斑为不具氨苄青霉素抗性的阴性菌落.

挑选其中的白斑菌落来进行克隆文库的构建,并对挑选出的阳性克隆子进行菌落PCR以剔除假阳性及假阴性克隆子.最后对用HhaI(Takara,Japan)限制性内切酶对阳性克隆子进行酶切.反应条件为37℃,4h.酶切反应在PCR仪中进行.酶切后的产物用3%琼脂糖凝胶电泳检测,并在凝胶成像仪中进行拍照观察,根据成像结果中的酶切带型划操作分类单元(opera tionaltaxonomic units，OTU).每个OTU挑取2~3个代表克隆子送到北京中美泰和技术公司进行测序.

1.2.4、16SrDNA基因克隆文库统计学性分析

基因文库的库容值(C)可以用来表示微生物基因文库多样性的覆盖率.理论上,当C为100%时表示该基因文库涵盖了样品中所有的微生物种类,库容值越高说明库的覆盖率越高.库容值计算公式[10]为

式中：N为基因文库的总克隆子数；n1为仅有一个克隆子的OTU数目.利用Shannon-Wiener指数(H)对基因文库的序列做多样性指数分析,计算公式为

1.2.5系统发育树的构建

将测得的序列利用NCBI网站上的Blast在线程序与Genbank中模式菌株序列进行比对,并下载同源性相对较高的序列.采用MEGA5.0软件中的邻接算法构建系统发育树,分析污泥样品中的微生物种类和分类地位.利用Bootstraps来分析评估系统发育树的稳定性,树的节点通过非参数支持率计算(进行1000次重复运算).

2结果与分析

2.1、DNA提取和PCR扩增

利用试剂盒提取细菌DNA以后,经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,在凝胶成像系统中拍照采集图像,与Marker比对后可知DNA片段长度约为23kb.采用通用引物对27F/1492R和AOB功能基因amoA的引物对amoA-1F/amoA-2R进行PCR扩增以后得到的目的基因片段长度分别约为1500、500bp,如图2所示.均满足试验要求.

图2克隆文库中PCR扩增电泳图

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