晚期垃圾渗滤液MBR亚硝化系统中细菌及功能菌的多样性

其中,丛毛单胞菌属(Comamonas)是常见的反硝化菌属,该菌属已经被研究发现能够降解多种难降解的环境污染物.由于基因背景的差异,不同丛毛单胞菌能够降解的污染物不同,同时降解途径和降解方式也不一样，对此研究者做了大量研究.Boon等[16]、Khan等[17]研究发现丛毛单胞菌属(Comamonas)可以利用难降解的芳香族化合物进行新陈代谢.

刘志培等[18]将苯胺作为ComamonasacidovoransAN3的唯一碳、氮源,推测出该菌降解苯胺的代谢途径.Schleheck等[19]研究了菌株ComamonastestosteroniKF-1降解3,4-磺苯基丁酸盐的代谢途径.

产碱杆菌属(Alcaligenes)是污水处理系统中常见的异养硝化菌.Anderson等[20]研究鉴定产碱杆菌属(Alcaligenes)中一株粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)为异养硝化细菌,该菌能在低碳条件下发生硝化，也可以在有机环境中进行硝化.

王成林等[21]从人工湿地中分离出一株异养硝化菌,经16SrDNA鉴定后为产碱杆菌属(Alcaligenes).关于罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)以及伯克霍尔德氏菌(Burkholderiagladioli)脱氮除磷的报道较少,这些细菌的脱氮作用还有待作进一步研究.反应器中丛毛单胞菌属(Comamonas)以及产碱杆菌属(Alcaligenes)等菌属的存在,使亚硝化系统中还可能存在一些其他脱氮途径，如同步硝化反硝化途径.

拟杆菌类群(Bacteroidetes)在系统中约占9.76%.拟杆菌是化能异养菌,能够降解纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等大分子有机物[22].另有研究指出,拟杆菌广泛存在于厌氧条件的污水处理系统[23].MBR亚硝化系统中随着污泥质量浓度的提高会造成菌胶团内部溶解氧过低,在菌胶团会形成微厌氧环境,这促进了拟杆菌作为优势菌的形成.

厚壁菌类群(Firmicutes)在微生物系统中占7.32%.其中经测序比对得到的代表菌属Planococcussp.属于芽孢杆菌类群(Bacillus).芽孢杆菌(Bacillus)广泛分布于自然界中,能够产生孢子,在恶劣环境中能够休眠,故有很强的生命力.芽孢杆菌(Bacillus)已经被报道能够降解多种污染物.

曾地刚等[24]通过研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对于养殖废水的净化作用,发现该类细菌对COD、亚硝酸盐、H2S均有显著去除作用;邵晴[25]针对养殖水体,分离得到一株高效氨氮降解菌和一株高效反硝化菌,经16SrDNA鉴定分别为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).

陈尚智等[26]通过研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对微污染水体的净化作用,也证实了芽孢杆菌(Bacillus)对COD、氨氮、亚氮、硝氮具有显著去除作用.Yang等[27]分离得到一株能够同时进行异养硝化和好氧反硝化的细菌，经16SrDNA鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),并对其脱氮性能进行了研究.以上可知,芽孢杆菌(Bacillus)对于降解有机污染物和污水脱氮除磷具有巨大潜力.目前,芽孢杆菌(Bacillus)多用于处理水产养殖废水,其在污水处理方面的应用还有待进一步研究.

系统中另一优势菌属为未培养菌,这表明MBR亚硝化系统中还存在着无法估量的微生物资源,有待进一步研究.另外,在序列同源性研究中,一般认为细菌16SrDNA序列同源性低于97%即属于不同的种[28].实验结果表明,系统中仍有58.54%的菌属序列与对比序列同源性低于97%.这也进一步说明了该系统中还有相当一部分微生物资源有待进一步发掘.

2.3亚硝化功能菌克隆文库构建及细菌多样性分析

在构建的反应系统16SrDNA通用克隆文库中,变形菌类群(Proteobacteria)为绝对优势菌属,多数脱氮菌及固氮菌也都分布在这一菌群.如污水系统中常见的好氧反硝化菌丛毛单胞菌(Comamonas)、硝化菌产碱杆菌(Alcaligenes)、异养硝化-好氧反硝化菌芽孢杆菌(Bacillus)、固氮菌伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)等.

这些具有脱氮功能的细菌多数为异养菌.这些类群的存在表明处理晚期垃圾渗滤液的MBR亚硝化系统中同时存在好氧反硝化、异养硝化和同步硝化反硝化等多种脱氮途径,它们对系统中的氮损失具有一定的贡献率.

然而,在以上文库中并没有检测到常见的AOB和亚硝酸盐氧化菌(nitrite oxidizing bacteria，NOB),这是由于自养菌繁殖速度慢,世代周期长,相对异养菌在数量上并不占优势.

因此,为了更好地分析系统中相对数量较少的AOB,采用针对AOB功能基因amoA的引物对进行PCR特异性扩增,构建AOB克隆文库.采用限制性内切酶HhaI对随机挑取的73个阳性克隆子进行酶切分型,每个酶切类型选2~3个代表克隆子送去测序,测得序列经比对后得到5个OTU.AOB克隆文库分析结果如表5所示.AOB系统发育树见图4.

表5MBR系统样品AOB克隆文库分析结果

图4亚硝化系统中AOBamoA基因的系统发育树

在AOB克隆文库中检测到两大优势菌群,分别是亚硝化单胞菌(Nitrosomonas，41.1%)和未培养菌(58.9%)，而并未检测到传统的硝化菌属——亚硝化杆菌属(Nitrosococcus)和亚硝化螺菌属(Nitrosospira).这一研究结果也与前人的研究结果相符.邵军等[29]采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技术研究垃圾渗滤液处理系统中微生物群落演替过程,经测序得到的AOB仅有亚硝化单胞菌(Nitrosomonas).

Limpiyakorn等[30]利用PCR-DGGE、克隆文库以及荧光定量PCR技术研究对比了在不同季节情况下12种不同污泥样品中AOB的多样性，结果表明：在所有样品中均检测到了亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)，并且只在A2O工艺的污泥样品中检测到了除亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)外的其他亚硝化菌.

Limpiyakorn等[31]还研究了不同氨氮质量浓度下污泥样品中AOB的多样性，利用分子生物学手段仅在污泥中检测到了亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas).因此，在处理晚期垃圾渗滤液的MBR亚硝化系统中起到亚硝化作用的菌属是亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas).

3结论

1)通过构建MBR亚硝化系统细菌通用克隆文库,得知系统中优势菌属主要包括4个类群,分别是Proteobacteria(64.65%)、未培养菌(18.3%)、Bacteroidetes(9.76%)和Firmicutes(7.32%).

2)通过构建MBR亚硝化系统AOB克隆文库分析系统中的脱氮功能菌,结果表明,在系统中起到亚硝化作用的氨氧化菌(AOB)主要是亚硝化单胞菌(Nitrosomonas).同时,好氧反硝化菌丛毛单胞菌属(Comamonas)、硝化菌产碱杆菌属(Alcaligenes)等菌的存在,揭示了系统中除了短程硝化和传统脱氮途径外,还可能存在其他新型脱氮途径.

3)在细菌通用克隆文库中检测到未培养菌占18.3%,在AOB克隆文库中也有58.9%的未培养菌.这一结果表明,系统中还蕴藏着丰富的微生物资源,有待进一步的研究.

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