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图 1 试验装置示意
试验共设2个反应器(分别记为1号、2号),1号反应器加入硫磺和白云石的混合物,2号反应器加入黄铁矿和白云石的混合物. 2个反应器中的填料均按1:1的体积比混合装填,硫磺、黄铁矿和白云石的粒径均为5~10 mm.其中,硫磺/白云石的填充区域孔隙率为45.9%,黄铁矿/白云石为44.1%.
1.2 进水水质和接种污泥
本试验用水为人工模拟污水厂尾水,水质指标为: NO3--N浓度为30 mg˙L-1,NH4+-N浓度为2 mg˙L-1,TP浓度为1 mg˙L-1,COD浓度为18~23 mg˙L-1,pH为6.8~7.2.接种污泥取自高碑店污水处理厂二沉池回流污泥.
1.3 反应器运行方式
反应器在低温下运行85 d (1月2日至3月26日),主要分为稳定期、饥饿期和恢复期:稳定期(1~30 d),正常进水,反应器稳定运行,平均温度为12℃;饥饿期(31~60 d),停止进水,反应器处于饥饿状态,平均温度12.8℃;恢复期(61~85 d),恢复进水,反应器进入恢复期,平均温度为14℃.饥饿期结束后及恢复期采集反应器中的污泥样品(1号饥饿期A1、恢复期A2;2号饥饿期B1、恢复期B2) 进行MiSeq高通量测序分析,分析反应器饥饿期及稳定期细菌群落的变化情况.
1.4 测试指标和方法1.4.1 水质指标的测定
反应器运行期间,定期采样进行水质指标的测定,检测项目包括硝酸盐氮(NO3--N)、亚硝氮(NO2--N)、总氮(TN)、总磷(TP) 等.其中NO3--N采用紫外分光光度法测定;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定;TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定;TP采用钼酸盐分光光度测定.试验所用分光光度计为HACH DR5000紫外可见分光光度计.生物量采用脂磷法测定.
1.4.2 微生物多样性的测定
DNA的提取与PCR的扩增:为了探究系统的细菌群落,在反应的饥饿期和恢复期进行取样.采用E. Z. N. A. Soil DNA试剂盒(美国Omega公司),按照试剂盒说明书提供的操作步骤提取.提取的DNA用1%琼脂凝胶电泳进行检测. PCR的扩增区域为16S rRNA的V3-V4区,细菌16S rRNA扩增引物采用通用引物(338F/806R).引物名称和引物序列分别是338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) 和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT). PCR反应体系: Forward primer (10 μmol˙L-1),2 μL;Reverse primer (10 μmol˙L-1),2 μL;dNTPs (2.5 mmol˙L-1),4 μL;10×PCR buffer,5 μL;Pyrobest DNA Polymerase (2.5 U˙μL-1),0.3 μL;补充ddH2O至50 μL.反应程序:先95℃预热5 min;然后进行25个循环(95℃变形30 s,56℃退火30 s,72℃延伸40 s),最后72℃延伸10 min.用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司) 回收PCR产物,经Tris-HCl洗脱后,用2%琼脂糖凝胶电泳检测.根据电泳结果.将PCR产物用QuantiFluorTM -ST (Promega公司) 进行定量,按照每个样品的测序量要求,进行相应比例的混合.
MiSeq文库构建与测序:用高通量测序平台Illumina MiSeq对扩增产物进行MiSeq高通量测序.测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接,同时过滤掉低质量的reads,区别样品后进行OUT聚类分析和物种分类学分析.
生物多样性和分类学分析:首先将序列按照彼此的相似性归为操作分类单元(OTU).按照97%相似性进行OUT聚类,采用RDP classifier对97%相似水平的OUT代表序列进行分类学分析.利用MOTHUR软件对样品覆盖率(coverage percentage),ACE,Chao丰富指数以及Shannon多样性指数进行计算.同时为了保证分析的高可信度,根据SILVA106库中的参考序列对OUT进行种属鉴定,种属比对的可信度阈值设定为80%.
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