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抗生素的滥用可提高和加速微生物的抗生素抗性。由于在过去的半个世纪中,微生物抗生素抗性的增长速率远远超过新型抗生素的发现与发明速度,抗生素抗性已成为了全球性的健康风险问题并受到广泛关注。据估计,全球每年约有70万死亡病例可归咎于耐药微生物感染。如果不采取任何措施,至2050年,这一死亡人数会进一步增长至每年1000万例。已有研究表明,传统污水处理工艺无法有效去除污水中的抗生素抗性细菌(Antibiotic resistant bacteria, ARB)和抗性基因(Antibiotic resistance genes, ARGs)。不仅如此,水处理过程中未被完全去除的抗生素以及其他化学物质(比如其他药物和重金属等)会促进抗性基因再污水处理设施中的水平转移,使微生物可以从周围环境中(比如污水处理设施中的不同处理单元)摄取游离的抗性基因从而获得抗生素抗性。
为了解决上述问题,加州理工学院Hoffmann教授研究组和克拉克森大学杨阳教授研究组结合紫外光和高级氧化消毒的原理,开发了一种基于二氧化钛蓝色纳米管(Blue TiO2nanotube arrays, BNTAs)材料的紫外光辅助电化学氧化(UV-assisted electrochemical oxidation, UV-EO)工艺,用于深度去除污水中ARB及ARGs。在该小试研究中,两种ARGs-四环素和磺胺甲恶唑抗性基因(tetA和sul1),以及被它们分别转化的耐四环素(tetracycline)和耐磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)经由UV-EO处理后分别由qPCR和选择性琼脂培养基进行定量分析。与单一紫外光消毒相比,UV-EO有效增强了ARB和ARGs的去除效率。其中,由电化学氧化氯离子 (Cl-)生成的自由氯以及随后发生的紫外光和氯的光催化反应使得去除效率被进一步提高。在Cl-存在的条件下,UV-EO(UV-EO/Cl-)基于光通量的一级动力学速率常数对长靶和短靶序列分别为单一紫外光辐照反应下的 2.1-2.3和1.3-1.8倍。通过凝胶电泳和动力学模型计算,我们进一步解析了质粒DNA被不同自由基破坏的反应机理。最后我们证明了UV-EO可以有效地消除厕所废水中的ARB和ARGs,尽管反应速率略低于模拟废水实验观测值。
图1:紫外光光电催化去除抗性细菌与基因研究的实验方案
UV-EO实验在可接收侧向UV辐照的光反应器中进行。我们使用了BNTA和铂网分别作为阳极和阴极电极,使用波长为254 nm的紫外光(UV254)为紫外光源。使用碘化钾作为化学露光计测得的反应池内的UV254辐照强度为5.0+0.1 mW/cm2。我们在厕所废水中检出较高浓度的两种ARGs-tetA和sul1。因此它们被选为本研究中的目标基因。如图1所示,我们设计了特定的引物并借助PCR扩增技术获得了两种目标ARGs的全长序列。这些序列被分别克隆进载体质粒中组装为分别含有tetA和sul1的新载体质粒- pEB1-tetA和pEB1-sul1。编辑后的载体质粒通过脉冲电穿孔技术转移至感受态细胞E. coliMegaX DH10B T1R,进而获得分别具有四环素和磺胺甲恶唑抗性的大肠杆菌细胞。我们研究了细胞内ARGs(intracellular ARGs, i-ARGs)和细胞外ARGs(extracellular ARGs, e-ARGs)在三种不同处理条件(UV254、UV-EO以及UV-EO/Cl-)下的去除效果。
图2:电极的导带、价带和费米能级示意图(a)二氧化钛纳米管,(b)二氧化钛蓝色纳米管以及(c)紫外光辐照下的二氧化钛蓝色纳米管
我们选用蓝色纳米管(BNTAs)作为电极材料。在此前的系列工作中(10.1021/acscatal.7b04340;10.1021/acs.est.6b03540),我们报道了蓝色纳米管独特的光电特性。BNTAs 特有的Ti3+掺杂态赋予其优秀的导电能力。这个物理现象直观表现为费米能级上移至导带(图2a 至b)。此时在合适的阳极电位下,外界电子可以通过隧穿效应注入导带,促成电化学氧化反应(图2b)。本研究发现,良好导电的BNTAs仍保有半导体材料的性质。在紫外光辐照下,光生电子可以稳定Ti3+掺杂态、提高材料在高阳极电位下的稳定性。同时光生空穴(h+)可以通过光催化路径产生更多的自由基和氧化剂。
图3:不同反应条件下苯甲酸探针分子的降解动力学及模型拟合结果
由于苯甲酸 (benzoic acid, BA)可与多种自由基反应的特性,我们使用BA作为探针分子间接定量分析了自由基的产量。通过动力学模型模拟,我们进一步估算了多种自由基(•OH、 Cl•、 Cl2•-、 ClOH•-等)的浓度。如图3所示,实验数据(点)能被动力学模型(虚线)较好地拟合。结合实验观测和模型模拟,我们发现在氯离子存在的条件下,Cl2•-、Cl•和•OH是EO反应中主要的自由基物种。紫外辐照能够通过均相光化学反应(游离氯光解)和异相催化反应(光生空穴氧化)提高EO 过程的自由基的产率。
图4:不同条件下二氧化钛蓝色纳米管对抗生素抗性大肠杆菌和抗性基因的去除动力学
我们进一步测试了抗生素抗性大肠杆菌在三种不同反应条件下(单一UV254、UV-EO/以及UV-EO/Cl-)的去除效果(如图4所示)。我们发现去除ARGs比杀灭ARB更具有挑战性。这可能因为除了ARG片段外,ARB细胞中的全基因组DNA序列中还有更多的“生死攸关”的靶点。此外自由基也可以通过破坏细胞其他结构(细胞壁)达到灭活的目的。这个结果进一步印证了前人研究中的结论,即ARGs可以在即使宿主ARB被灭活的情况下幸存,从而继续通过基因的水平转移传播抗生素抗性。我们的研究结果表明,与单一UV254工艺相比, UV/EO可借助自由基氧化反应提高ARB和ARGs的去除效率。三种不同条件下ARB和ARGs的去除效率由高到低的顺序为:UV-EO/Cl-> UV-EO > UV 。对上述反应条件下长靶和短靶序列的降解曲线在符合一级多力学的范围内分别进行一级动力学拟合,由此可得基于光通量的一级动力学常数。结果表明与单一UV254相比,UV-EO可将ARGs长靶和短靶序列的降解速率分别提高至1.5-1.6和1.1-1.3倍。引入Cl-可将其降解速率进一步分别提高至2.1-2.3和1.3-1.8倍。长靶序列由于含有更多的攻击点位,其降解速率显著高于短靶序列。此外,对于同一靶序列,e-ARGs的降解速率普遍高于i-ARGs,除了一组tetA-short在单一UV254辐照下的降解实验中e-ARGs与i-ARGs降解速率并无显著不同之外。
图5:不同去除条件下含抗性基因的质粒DNA随时间变化的凝胶电泳图
对上文提到的经三种不同条件下处理了不同时间的质粒pEB1-sul1进行凝胶电泳测试(如图5)。结果表明,在较低剂量的UV254辐照下,质粒主要发生碱基对的改变。只有在足够高剂量(> 1.5 J/cm2)的单一UV254辐照下,质粒才会发生形态变化。而UV-EO显著加速了质粒的形态变化。
图6:二氧化钛蓝色纳米管-紫外光光电催化对厕所废水中原始细菌和抗性基因的去除
最后,我们测试了UV-EO 工艺的对厕所废水中细菌和ARGs的处理效果(如图6)。实验结果显示,在300 mJ/cm2的UV254辐照剂量下,废水中的细菌的去除率达到2.7-log10。在600 mJ/cm2的UV254辐照剂量下,两个长靶序列tetA-long和sul1-long的去除率分别达到1.1-log10和2.9-log10,而两个短靶序列去除率接近2-log10。UV-EO对废水中ARGs的处理效率低于模拟废水处理结果。原因可能包括1)自由基和游离氯被废水中其他化合物(比如氨氮和有机物)消耗;2)紫外光被废水中其他污染物吸收;3)废水中细菌及ARGs浓度远低于模拟废水。值得注意的是,我们发现UV-EO 可以在降解COD和氨氮之前优先去除ARB和ARGs。
综上所述,使用BNTA作为阳极的UV-EO工艺实现了对ARB和ARGs的高效去除。与单一紫外光辐照相比,UV-EO提高了ARB和ARGs的去除效率。我们认为电化学氧化工艺可被整合入现有的紫外消毒单元中(如开发柔性多孔电极包裹在UV光管上)从而解决ARB和ARGs带来的新挑战。
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