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分离自活性污泥的硫酸盐还原菌用于铅锌冶炼渣重金属污染修复

北极星环境修复网  来源:微生物学通报  作者:闫潇  2019/6/12 14:44:01  我要投稿  
所属频道: 环境修复  关键词:硫酸盐还原菌 活性污泥 修复 

1.2.2 复壮硫酸盐还原菌

在无菌操作台将冻干保藏的菌粉取出转移至装有5mL 的液体培养基的试管中摇匀,取1mL菌液转接到装有100mL培养液的锥形瓶中,30 °C条件下厌氧培养5d。采用紫外可见分光光度计在波长为600nm处测定其OD600值,当值OD600为0.8时再次转接到新鲜培养液中,如此传接3~5次备用,每次转接前用硫酸铅(PbSO4)试纸检测是否有硫化氢生成,并在显微镜下观察微生物状态。

1.2.3 构建硫酸盐还原菌修复体系

将自然风干后的铅锌冶炼渣调配均匀,分别取150g加入6个500mL的锥形瓶中,按照修复培养基配方各制备900mL液体培养基,分别平均添加到锥形瓶中,然后各取15mL复壮后的硫酸盐还原菌的菌液在4500r/min下离心3.5min,弃去上清液后,将菌泥分别接种到3个锥形瓶中设置为修复组,另3个未接菌的设置为对照组,30 °C 且CO2稳定在5%的条件下厌氧培养。

1.2.4 冶炼渣的酸碱性及氧化还原电位测定

在第10、20、30、40、50和60d分别取对照组和修复组的溶液,采用pH计和高电阻直流电位差计测定液体的pH值和ORP值。每次测定前需使用标准液进行校正。

1.2.5 冶炼渣中重金属固化的研究

固化作用是通过微生物自身代谢活动改变冶炼渣中重金属结合态,转化为毒性低、迁移性小、生物可利用性低的稳定态。其中以修复过程中样品重金属离子稳定态的增加量来衡量修复效果。硫酸盐还原菌固化冶炼渣中重金属的能力,既与微生物菌群丰度有关,也与修复时间有关。具体操作:在第10、20、30、40和50天分别对修复组和对照组取样,用紫外可见分光光度计在波长为600nm处测定其OD600值。另外,各取10mL经0.45μm的滤膜过滤,然后将滤液转移到含有5%稀硝酸的容量瓶中,摇匀后静置2h,最后通过ICP-OES测定各种重金属离子浓度[23-24]。每次取样后,修复组添加同等体积的培养基,对照组添加同等体积的去离子水。

1.2.6 冶炼渣中不同形态的重金属提取及测定

分别取原渣样修复30和60d样品自然风干,研磨至200目,各准确称取2g(精确到0.0001g)样品,编号装入带盖50mL聚丙烯离心管中,按照修改后的Tessier法进行分步提取操作。具体操作如下:

(1) 水溶态。加入16mL去离子水,自然pH条件下,25 °C连续振荡30min,8800r/min离心13min,取上清液用0.45μm滤膜过滤至25mL容量瓶中待测。去离子水洗涤残余物,离心弃去上层清液。

(2) 可交换态。加入16mL 1 mol/L的MgCl2溶液,调节pH7.0,25 °C 下连续振荡1.5h,8800r/min 离心13min,取上清液用0.45 μm 滤膜过滤,加入5%的硝酸,定容至25mL容量瓶中待测。去离子水洗涤残余物,离心弃去上层清液。

(3) 碳酸盐结合态。第2步的残渣加16mL 1 mol/L NaAc溶液调至pH5.0,25 °C下连续振荡6h,8800r/min 离心13min,取上清液用0.45 μm滤膜过滤,加入5%的硝酸于25mL容量瓶定容后待测。去离子水洗涤残余物,离心弃去上层清液。

(4) 铁锰氧化物结合态。第3步的残渣加16mL 0.04 mol/LNH2OH·HCl的25%HAc溶液,在97 °C水浴锅中恒温间断振荡5h,静置水浴30min,振荡30min交替进行。8800r/min 离心13min,取上清液用0.45 μm滤膜过滤,加入5%的硝酸于25mL 容量瓶定容后待测。去离子水洗涤残余物,离心弃去上层清液。

(5) 有机结合态和硫化物结合态。向上一步的残渣加5mL 0.01 mol/L HNO3和8mL 30%H2O2 ,用HNO3调节至pH2.0,水浴加热到87 °C,间断振荡2h,加入5mLH2O2调节pH2.0,继续间断振荡2h后,冷却到26 °C,再加入5mL 3.2 mol/LNH4Ac 的20%HNO3溶液,连续振荡30min,8800r/min 离心13min,取上清液用0.45μm滤膜过滤,加入5%的硝酸于25mL 容量瓶定容后待测。去离子水洗涤残余物,离心弃去上层清液。

(6) 残渣态。在200 °C分别加入HCl、HNO3 、HClO4消煮。残留态消解的步骤与全量提取法的步骤相同,即将上一步剩下的残渣转移至200mL的烧杯中,加入15mLHCl消煮10min后,加入5mL的HNO3,消煮30min后加入5mL的HClO4,消煮2h后降低温度为160 °C继续消煮30min。最后将溶液过滤后转移至100mL的容量瓶中定容,用ICP-OES测定所需重金属离子浓度。

1.2.7 微生物群落结构的检测

采集不同修复时段(原渣样,修复30和修复60d)的样品于塑料袋中,4°C密封送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行高通量测序[25-26]

用原核生物16SrRNA基因V3-V4区的通用引物开展高通量扩增子测序分析,用HiSeq2500平台结合PE250进行测序,群落组成与多样性用QIIME、Mothur、UPARSE软件分析,跟踪修复过程中的微生物种群结构改变。研究不同样品微生物的多样性、丰度、种群结构和空间分布的差异[27]

2 结果与分析

2.1 矿物组成分析

由图1可见,铅锌冶炼渣中主要成分为硫酸盐类物质,其中包括硫酸钙(CaSO4)、硫酸锌(ZnSO4)和硫酸铁类物质[Fe(SO4)2(OH)5H2O]等。

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2.2 硫酸盐还原菌(SRB)作用下冶炼渣的酸碱性及氧化还原电位

(1) 样品修复过程中的pH值

为避免样品溶解后自身 pH 可能对微生物修复过程产生影响,跟踪测定该过程中铅锌冶炼渣上清液在 1 mol/L KCl 溶液中的 pH 变化。铅锌冶炼渣的初始pH值为4.35。经不同时段取样检测pH的变化如图2可见,对照组和修复组pH变化显著,在整个过程中对照组pH(4.0~5.0)变化不明显,仍然处于酸性环境;而修复组pH的变化为先升高后平缓逐渐调节至中性(pH7.0左右),铅锌冶炼渣的酸性环境得到改善。

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