分离自活性污泥的硫酸盐还原菌用于铅锌冶炼渣重金属污染修复

1.2.2 复壮硫酸盐还原菌

在无菌操作台将冻干保藏的菌粉取出转移至装有5mL 的液体培养基的试管中摇匀，取1mL菌液转接到装有100mL培养液的锥形瓶中，30 °C条件下厌氧培养5d。采用紫外可见分光光度计在波长为600nm处测定其OD₆₀₀值，当值OD₆₀₀为0.8时再次转接到新鲜培养液中，如此传接3~5次备用，每次转接前用硫酸铅(PbSO₄)试纸检测是否有硫化氢生成，并在显微镜下观察微生物状态。

1.2.3 构建硫酸盐还原菌修复体系

将自然风干后的铅锌冶炼渣调配均匀，分别取150g加入6个500mL的锥形瓶中，按照修复培养基配方各制备900mL液体培养基，分别平均添加到锥形瓶中，然后各取15mL复壮后的硫酸盐还原菌的菌液在4500r/min下离心3.5min，弃去上清液后，将菌泥分别接种到3个锥形瓶中设置为修复组，另3个未接菌的设置为对照组，30 °C 且CO₂稳定在5%的条件下厌氧培养。

1.2.4 冶炼渣的酸碱性及氧化还原电位测定

在第10、20、30、40、50和60d分别取对照组和修复组的溶液，采用pH计和高电阻直流电位差计测定液体的pH值和ORP值。每次测定前需使用标准液进行校正。

1.2.5 冶炼渣中重金属固化的研究

固化作用是通过微生物自身代谢活动改变冶炼渣中重金属结合态，转化为毒性低、迁移性小、生物可利用性低的稳定态。其中以修复过程中样品重金属离子稳定态的增加量来衡量修复效果。硫酸盐还原菌固化冶炼渣中重金属的能力，既与微生物菌群丰度有关，也与修复时间有关。具体操作：在第10、20、30、40和50天分别对修复组和对照组取样，用紫外可见分光光度计在波长为600nm处测定其OD₆₀₀值。另外，各取10mL经0.45μm的滤膜过滤，然后将滤液转移到含有5%稀硝酸的容量瓶中，摇匀后静置2h，最后通过ICP-OES测定各种重金属离子浓度^[23-24]。每次取样后，修复组添加同等体积的培养基，对照组添加同等体积的去离子水。

1.2.6 冶炼渣中不同形态的重金属提取及测定

分别取原渣样修复30和60d样品自然风干，研磨至200目，各准确称取2g(精确到0.0001g)样品，编号装入带盖50mL聚丙烯离心管中，按照修改后的Tessier法进行分步提取操作。具体操作如下：

(1) 水溶态。加入16mL去离子水，自然pH条件下，25 °C连续振荡30min，8800r/min离心13min，取上清液用0.45μm滤膜过滤至25mL容量瓶中待测。去离子水洗涤残余物，离心弃去上层清液。

(2) 可交换态。加入16mL 1 mol/L的MgCl₂溶液，调节pH7.0，25 °C 下连续振荡1.5h，8800r/min 离心13min，取上清液用0.45 μm 滤膜过滤，加入5%的硝酸，定容至25mL容量瓶中待测。去离子水洗涤残余物，离心弃去上层清液。

(3) 碳酸盐结合态。第2步的残渣加16mL 1 mol/L NaAc溶液调至pH5.0，25 °C下连续振荡6h，8800r/min 离心13min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤，加入5%的硝酸于25mL容量瓶定容后待测。去离子水洗涤残余物，离心弃去上层清液。

(4) 铁锰氧化物结合态。第3步的残渣加16mL 0.04 mol/LNH₂OH·HCl的25%HAc溶液，在97 °C水浴锅中恒温间断振荡5h，静置水浴30min，振荡30min交替进行。8800r/min 离心13min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤，加入5%的硝酸于25mL 容量瓶定容后待测。去离子水洗涤残余物，离心弃去上层清液。

(5) 有机结合态和硫化物结合态。向上一步的残渣加5mL 0.01 mol/L HNO₃和8mL 30%H₂O₂ ，用HNO₃调节至pH2.0，水浴加热到87 °C，间断振荡2h，加入5mLH₂O₂调节pH2.0，继续间断振荡2h后，冷却到26 °C，再加入5mL 3.2 mol/LNH₄Ac 的20%HNO₃溶液，连续振荡30min，8800r/min 离心13min，取上清液用0.45μm滤膜过滤，加入5%的硝酸于25mL 容量瓶定容后待测。去离子水洗涤残余物，离心弃去上层清液。

(6) 残渣态。在200 °C分别加入HCl、HNO₃ 、HClO₄消煮。残留态消解的步骤与全量提取法的步骤相同，即将上一步剩下的残渣转移至200mL的烧杯中，加入15mLHCl消煮10min后，加入5mL的HNO₃，消煮30min后加入5mL的HClO₄，消煮2h后降低温度为160 °C继续消煮30min。最后将溶液过滤后转移至100mL的容量瓶中定容，用ICP-OES测定所需重金属离子浓度。

1.2.7 微生物群落结构的检测

采集不同修复时段(原渣样，修复30和修复60d)的样品于塑料袋中，4°C密封送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行高通量测序^[25-26]。

用原核生物16SrRNA基因V3-V4区的通用引物开展高通量扩增子测序分析，用HiSeq2500平台结合PE250进行测序，群落组成与多样性用QIIME、Mothur、UPARSE软件分析，跟踪修复过程中的微生物种群结构改变。研究不同样品微生物的多样性、丰度、种群结构和空间分布的差异^[27]。

2 结果与分析

2.1 矿物组成分析

由图1可见，铅锌冶炼渣中主要成分为硫酸盐类物质，其中包括硫酸钙(CaSO₄)、硫酸锌(ZnSO₄)和硫酸铁类物质[Fe(SO₄)₂(OH)₅H₂O]等。

2.2 硫酸盐还原菌(SRB)作用下冶炼渣的酸碱性及氧化还原电位

(1) 样品修复过程中的pH值

为避免样品溶解后自身 pH 可能对微生物修复过程产生影响，跟踪测定该过程中铅锌冶炼渣上清液在 1 mol/L KCl 溶液中的 pH 变化。铅锌冶炼渣的初始pH值为4.35。经不同时段取样检测pH的变化如图2可见，对照组和修复组pH变化显著，在整个过程中对照组pH(4.0~5.0)变化不明显，仍然处于酸性环境；而修复组pH的变化为先升高后平缓逐渐调节至中性(pH7.0左右)，铅锌冶炼渣的酸性环境得到改善。