冠状病毒在水和废水中的存活

摘要：严重急性呼吸综合征的出现及其潜在的环境传播表明，需要更多关于冠状病毒在水和废水中存活的信息。在过滤和未过滤的自来水(4℃和23℃)和废水(23℃)中测定了代表性冠状病毒猫传染性腹膜炎病毒和人冠状病毒229E的存活率。在相同的试验条件下，将其与脊髓灰质炎病毒1型进行了比较。试验水中冠状病毒的失活高度依赖于温度、有机物水平和拮抗细菌的存在。病毒效价下降99.9% (T99.9)所需的时间表明，在自来水中，冠状病毒在23℃(10天)水中比在4℃(>100天)水中灭活得更快。冠状病毒在废水中迅速死亡，T99.9值在2～4天之间。除了4℃自来水外，脊髓灰质炎病毒在所有测试水中的存活时间都比冠状病毒长。

介绍

2003年严重急性呼吸系统综合症(SARS)在全世界造成了8000多例病例产生，死亡率约为10%(Manocha et al. 2003;Centers for Disease Control 2004)。最后已知的爆发是在2004年北京的一个研究实验室。这种疾病的原因被确定为一种新的人类冠状病毒，很可能起源于麝猫，潜在宿主可能是蝙蝠(Guan et al. 2003; Lau et al. 2005; Wanget al. 2006)。冠状病毒是有包膜的单链RNA病毒，大小从60～220纳米不等。它们可以感染鸟类和哺乳动物，包括人类，并通过气溶胶或粪便-口腔途径传播。冠状病毒在爆发期间的迅速传播表明，人类冠状病毒的主要传播方式是呼吸道飞沫；然而，没有直接证据支持这一点(Belshe 1984)。由于迄今为止人类冠状病毒感染被认为是一种温和的、自我限制的疾病，因此关于其在环境中的传播潜力的信息有限。

鉴于2003年3月在香港高层住宅区爆发的涉及300多人的SARS疫情与一个有缺陷的污水系统有关(Peiris et al.2003)，SARS疫情传播可能与水和废水有关。SARS-CoV可在肠道内复制 (Leung et al. 2003)，这一事实使其成为一种可能的肠道病原体，而SARS病例中腹泻的发生率在8%～73%之间(SARS流行病学工作组，2003)，这引起了人们对其潜在环境传播的关注。Leung等人(2003)还报道，从SARS患者小肠中获得的病毒培养物产量高于作为该病毒靶器官的肺组织。传染性病毒是从SARS患者感染后3周内的粪便中分离出来的(Chan et al. 2004; Liu et al. 2004)。SARS的出现及其传播问题表明需要更多的信息，特别是冠状病毒在水和废水中的存活情况。本研究比较了代表性冠状病毒和脊髓灰质炎病毒1型在自来水和废水中的存活情况。02

材料和方法

猫传染性腹膜炎病毒(FIPV) (ATCC-990)：一种猫科动物的肠道冠状病毒，在克兰德尔里瑟猫肾细胞系(CRFK) (ATCC-94)中繁殖和检测。人冠状病毒229E (HCoV) (ATCC-740)：一种呼吸道病毒，在胎儿肺成纤维细胞，MRC-5细胞系(ATCC-171)中繁殖和分析。脊髓灰质炎病毒1 LSc-2ab (PV-1)：一种已知的在环境中非常稳定的人类肠道病毒，在布法罗绿猴肾(BGM)细胞系中繁殖和检测。在单层细胞中观察到细胞致病作用(CPE)后，将感染细胞在-20℃冷冻和解冻三次以释放病毒。随后在1000g离心10分钟以除去细胞碎片，加入到9%聚乙二醇(相对分子质量8000)和0.5 M氯化钠的病毒悬浮液中，并在4℃下搅拌过夜。在10000g离心30分钟后，用0.01 M磷酸盐缓冲盐水(PBS; pH 7.4)(Sigma, St. Louis, MO)重悬至原始病毒悬液体积的5%。然后将冠状病毒进行效价测定并储存在-80℃下。脊髓灰质炎病毒通过用等体积的Vertrel XF (Dupont, Wilmington，DE)提取进一步纯化，乳化后以7500g离心15分钟，随后收集顶层水层，进行效价测定并在-80℃储存。

自来水样本是从实验室的冷水龙头中采集的。水源是地下水，水质参数: pH 7.8，溶解固体297mg/L，总有机碳0.1mg/L。在收集样品之前，让水流动3分钟。在未过滤的自来水和通过0.2μm孔径过滤器去除细菌的自来水中测定病毒存活率。将自来水(30mL)加入到无菌的50mL聚丙烯离心管中，以减少附着在容器上的病毒损失。添加无菌硫代硫酸钠至最终浓度33μg/mL，以使水脱氯。涡旋后，将病毒添加到每个管中，最终浓度为105TCID50/mL。再次涡旋离心管并立即取样(零时间点)。然后将离心管储存在4℃或室温下(23℃)。室温下储存的离心管用铝箔覆盖，以防暴露在光线下。在1、3、6、10、15和21天后对离心管取样，并将样品在-80℃下冷冻，直到它们在细胞上被分析。初级出水和剩余活性污泥(二级)的样品来自于美国亚利桑那州图森市罗杰路污水处理厂，并收集在无菌聚丙烯瓶中。沉淀后收集初级出水，氯化前收集二级出水。该设施一级出水的典型水质参数为生物需氧量(BOD)和1悬浮固体(10～220mg/L)。通常相比初级出水，二级出水中的BOD和悬浮固体减少了90%～95%。将出水(30mL)加入到无菌的50mL聚丙烯离心管中。在添加病毒之前，一级出水通过0.2μm孔径的过滤器过滤，并且未经过滤的也进行测试。二级出水仅未经过滤的进行测试。然后将病毒添加到每个离心管中，最终浓度为105TCID50/mL。将离心管涡旋，立即取样(零时间点)。然后将离心管覆盖并保持在室温(23℃)。在1、2、3、6、10、15和21天后收集样品，并将样品在-80℃下冷冻直至分析。使用噬斑试验或TCID50技术在细胞培养物上计数病毒。在6孔塑料细胞培养板中，通过噬斑测定法(Payment and Trudel 1993)测定了PV-1的效价。这是一种直接定量方法，最低检测限为10 pfu/mL。将每种稀释液接种在两个孔中。在细胞培养中不形成斑块的冠状病毒，通过组织培养感染剂量50%技术(TCID50)在24孔塑料细胞培养板中测定其效价(Payment and Trudel 1993)。这种技术确定了显示出CPE的50%的原液的稀释度。取稀释倍数的反对数，得到每毫升TCID50的病毒效价。该方法的最低检测值为每毫升3.7个病毒。将每种稀释液接种在至少8个孔中。在添加病毒之前，任何来自测试水的样品都必须在细胞培养检测之前过滤，以消除细菌污染。在pH为7下使3%牛肉提取物(Becton Dick-inson，Sparks，MD)通过以阻断可能吸附病毒的位点来制备具有聚醚砜(PES)膜的0.2 μm低蛋白结合Millex过滤器(Millipore, Billerica, MA)。所有实验重复三次。03

结果和讨论

表1显示了三种病毒在测试水中的存活天数。每种病毒的对数减少量由公式“lgN/N0”计算，其中N是指定日期的病毒效价，N0是时间为0的病毒效价。线性回归的斜率用于确定存活率；病毒效价下降99%和99.9%所需的时间(分别表示为T99和T99.9)。

影响病毒在水中存活的因素包括温度、有机物和好氧微生物(John and Rose 2005; Melnick and Gerba 1980; Sobseyand Meschke 2003)。对病毒存活最关键的影响因素就是温度。已有研究表明，病毒存活率随着温度的升高而降低，这主要是由蛋白质变性和胞外酶活性增加引起的(Hurst et al. 1980; John and Rose2005)。自来水研究的结果证实冠状病毒就是这种情况。通过测试过滤后的自来水，我们减少或消除了颗粒有机物和细菌的影响。在室温下，只需要10天就能使过滤后的自来水中的冠状病毒减少99.9%，而在4℃时，这种程度的病毒灭活则需要100天以上。PV-1在自来水中4℃的存活与冠状病毒相似，但在室温(23℃)下，该病毒在过滤水和未过滤水中的存活时间都延长了六倍。图1和图2分别显示了三种研究病毒在室温(23℃)和4℃下在自来水中的存活情况。随着时间的推移，病毒效价从4℃水中的初始效价上升，这可能是由于病毒倾向于形成聚集物然后分解，而不是由于病毒在样本中的复制。

图1室温（23℃）条件下三种病毒在脱氯、过滤后自来水中的对数减少量

图2 4℃条件下三种病毒在脱氯、过滤后自来水中的对数减少量（*代表未过滤）

水中有机物和悬浮固体的存在可以为吸附在这些颗粒上的病毒提供保护，但同时如果这些固体沉淀下来，也可以成为去除病毒的一种机制。从自来水到二级出水再到一级出水，测试水中的有机物和悬浮固体含量都有所增加。过滤后的自来水比未过滤的自来水对冠状病毒灭活作用更强。此外，HCoV在未过滤的一级出水中的存活时间比过滤后的长。这表明较高的固体含量确实为水中的冠状病毒提供了保护。然而，对PV-1来说，过滤对其在自来水中的存活影响很小。在一级出水中，经过滤出水中的PV-1存活时间是未经过滤出水中的三倍。值得注意的是，在添加到废水中的时间和立即回收用于测试的时间(零时间点)之间，冠状病毒的效价显著降低。加入废水后，冠状病毒的效价立即下降了99.9%，而PV-1效价仅下降了10%。这种减少可能是由于废水中溶剂和洗涤剂的存在，它们会破坏病毒包膜并最终使病毒失活。这也可能表明冠状病毒比PV-1更容易吸附废水中的固体。病毒包膜的疏水性使得冠状病毒在水中的溶解性降低，因此增加了这些病毒粘附在固体上的可能性。废水样本必须经过过滤，以防止细菌污染细胞单层，这将去除颗粒物和任何与之相关的病毒。捕食性微生物如原生动物的存在可以增加水中病毒的失活率，蛋白酶和核酸酶也有这种作用(Gerba et al.1978; John and Rose 2005)。与二级出水相比，初级出水的细菌和固体含量都较高。所有三种测试病毒在未过滤的初级出水中的存活时间都比未过滤的二级出水长，尽管对FIPV来说这是可以忽略的。这再次表明，废水中的颗粒物相关病毒受到保护，不会被捕食和灭活。然而，冠状病毒在3天后低于最低检测限，而PV-1在21天后仍可检测到。废水中研究病毒的平均对数减少结果列于表2。

结论

这项研究的结果表明，冠状病毒比PV-1对温度更敏感，并且PV-1和冠状病毒在废水中的存活性有相当大的差异。其部分可能原因是包膜病毒在环境中不如非包膜病毒稳定。冠状病毒在废水中很快死亡，在2～3天内减少了99.9%，这与SARS-CoV存活数据相当(Wang et al. 2005a, b)。冠状病毒在初级出水中的存活时间仅略长于二级出水，这可能是因为悬浮固体含量较高，可以防止其失活。PV-1比冠状病毒存活时间长得多，初级出水需要10天，二级出水需要5天，才能达到与冠状病毒相当的灭活率。本研究表明，冠状病毒在水环境中的传播要比肠道病毒少，因为在环境温度下，冠状病毒在水中和废水中会更快地失活。