剩余污泥中纤维素半纤维素微生物降解技术

2.3 气体组分测定

实验中采用气相色谱仪(GC-2014型)检测血清瓶中产生的甲烷等气体，测定方法为外标法;选取标定物为高纯度标准氢气和甲烷制定标准曲线，如图  1所示.

图 1 气相色谱标准曲线

2.4 木聚糖酶活性测定

2.4.1 测定原理

木聚糖经过木聚糖酶水解后会生成寡糖和单糖.由于寡糖具有还原性末端和单糖具有还原基团，所以，导致两者在沸水浴条件下与DNS试剂会发生显色反应.因显色反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，且还原糖量又与待测液中木聚糖酶活性成正比，所以，可通过显色反应强度来推算木聚糖酶活性.

2.4.2 测定方法

取 1%木聚糖标准溶液3.6 mL，滴入25 mL 具塞刻度试管中;加入0.4 mL适当稀释的富集培养上清液，于35 ℃水浴锅中保温30  min;加入6 mL DNS溶液，混匀，沸水浴15 min;冷却至室温，定容到25 mL，在540  nm测定溶液吸光度.平行测定加入灭活上清液的空白对照组.

2.4.3 酶活性计算方法

木聚糖酶活性单位是指每min催化木聚糖水解生成1 μmol木糖所需的酶量，其中一个酶活性单位为U.酶活性计算公式(李彩霞等，2001)为：

式中，H为木聚糖酶酶活性(U ˙ mL-1);D为酶液稀释倍数;V1为比色管定容体积(mL);CX为木糖浓度(μmol ˙  mL-1);T为反应时间(min);V2为酶液体积(mL).

2.4.4 标准曲线

采用高纯度木聚糖溶液制定标准曲线(外标法)，标定溶液中木聚糖酶活性，测得的标准曲线如图  2所示.该方法可准确地检测出反应液中的木糖含量，从而可以根据计算公式推算出待测液中木聚糖酶活性.

图 2 木聚糖酶活性标准曲线

2.5 荧光显微镜镜检

本实验，微生物实验观察采用荧光显微镜(Zeiss Axioskop  40，正置式)进行，并配备了荧光激发光源和滤光片组，以确保红、绿、蓝色荧光观察能够正常进行.此外，显微镜还配置以数码相机，可实现对观察到的微生物进行实时拍摄，并随之通过配置的AxioVision软件进行分析，以产生准确的数据信息.

2.6 荧光原位杂交(FISH)实验

荧光原位杂交(FISH)被用于鉴定富集培养系统中细菌种类.首先，对测试泥样用4%多聚甲醛固定2 h;再对固定后的泥样离心，并在1×PBS  中重新悬浮(重复3次).其次，对泥样进行机械破碎，并将破碎泥样滴加在明胶包被的载玻片上，分别用50%、80%和98%酒精浸泡3  min.再次，将荧光标记的寡核苷酸探针(见表 3)溶解于杂交缓冲液中(组成：0.9 mol ˙ L-1 NaCl，0.02 mol ˙  L-1Tris-HCl(pH=7.4)，0.01% SDS和35% 去离子甲酰胺(DFA))，并在46 ℃下与污泥样品杂交2  h.杂交结束后，采用清洗液(组成：0.005 mol ˙ L-1 EDTA(pH=8.0)，0.02 mol ˙ L-1 Tris-HCl(pH=7.2)，0.  01%SDS和0.9 mol ˙ L-1 NaCl)在48 ℃下洗脱20 min.最后，对每个污泥样品用荧光显微镜(Zeiss Axioskop  40)随机拍照并进行定量分析.

表3 鉴定木聚糖降解菌的寡核苷酸序列探针

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