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图3-1使用大肠杆菌生物膜(绿色)来捕获不同大小和成分(粉红色)的纳米粒子。
在大肠杆菌中,生物膜合成主要通过两个curl操纵子介导(Barnhart & Chapman 2006)。 Curli纤维促进细胞表面和细胞 - 细胞粘附,生物膜合成,并且是EPS的主要蛋白质组分(Reichhardt等,2015,Barnhart & Chapman 2006)。 操纵子(csgBA和csgDEFG)控制生物膜形成所必需的六种蛋白质的表达(图3-1)。 CsgA和CsgB是可以聚合形成卷曲纤维的卷曲单体;CsgD是csgBA转录的激活剂(图3-1)。 CsgE,CsgF和CsgG帮助将CsgA和CsgB导出到细胞外。 操纵子csgDEFG可被OmpR蛋白激活,随后所有六种蛋白质的表达增加生物膜的形成(Barnhart & Chapman 2006)。
图3-1两个curli操纵子:csgBA和csgDEFG——直接生物膜合成。 图:Justin Y.
通过过表达CsgD,OmpR234(组成性活性的OmpR的突变形式)或两者来构建三种构建体以上调curli产量。 项目团队从iGEM分发试剂盒中获得所有所需部件:强启动子和强RBS组合(BBa_K880005)以最大化蛋白质生产,强RBS(BBa_B0034),csgD(BBa_K805015),ompR234(BBa_K342003)和双终止子(BBa_B0015) 转录。
图3-2 BBa_K2229100:CsgD的表达,构建包括强启动子,强RBS,csgD和双终止子。 图:Justin Y.
图3-3 BBa_K2229200:OmpR234的表达,构建包括强启动子,强RBS,ompR234和双终止子。 图:Justin Y.
为了最好的表达CsgD和OmpR234(图3-4,BBa_K2229300),在中间体BBa_S05398(ompR234双重终止子)前面插入强RBS(BBa_B0034)以制造BBa_S05399(RBS+ompR234+双终止子)。 最后,在BBa_S05399之前插入BBa_S05397(K880005+csgD)以完成完整的构建体组装(BBa_K2229300)(图3-4)。
图3-4 BBa_K2229300:CsgD和OmpR234的表达,构建包括强启动子,两个强RBS,csgD,ompR234和双终止子。 图:Justin Y.
假设如果过表达CsgD,OmpR234或两者(图3-5),则生物膜产量会上调(按递增顺序)。 CsgD的过表达会导致更多的单体,但是没有转运蛋白将这些单体携带出细胞。 OmpR234的过表达将允许卷曲单体被输出并形成卷曲纤维和生物膜。 最后,当CsgD和OmpR234过表达时,应制备两倍量的单体,并输出以形成更多的卷曲纤维和生物膜。
图3-5 CsgD和/或OmpR234的过表达不同程度地上调curli操纵子。如果过度表达A)CsgD,B)OmpR234或C)两者,生物膜产量会上调(按递增顺序)。 图:Justin Y.
项目展望
本项目的应用目的是去除工业和生活污水中的纳米粒(NP)子。因为随着近年来多种新兴纳米材料的使用普及,NPs在污水中的含量在逐年增加。而虽然NPs具有多种用途,但是脱落的NPs释放到环境当中会给人身健康和生态环境带来潜在的威胁。项目团队同时使用了两种策略,一种是通过识别NPs的封端剂柠檬酸盐在捕获NPs,另一种是通过生物膜在捕获NPs。虽然是高中队伍,但是台北美国学校iGEM出色证明了他们在项目中设计策略的可行性,为未来有效的去除污水中的NPs提供了可行的方案。
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