北极星水处理网讯:伴随着抗生素在养殖业和医疗业的大量使用，抗生素抗性基因(antibioticresistancegenes，ARGs)污染逐渐被人们重视。近年来我国浙江、上海、广东、河北等多个地区均有报道存在不同程度的抗生素抗性基因污染。尽管国内外对于抗生素抗性基因转移、去除开展了大量研究，但多局限于实验室内模拟阶段，工程实践方面报道较少，尤其对于抗生素抗性基因含量高于生活污水且低于养殖废水的屠宰废水，在污水处理工程中去除和累积情况未见报道。为此深入研究屠宰废水中抗生素抗性基因在污水处理各工艺中去除与累积效果，对于优化废水处理工艺和控制抗生素抗性基因污染具有重要现实意义。
本研究以2种磺胺类抗性基因(sul1、sul2)和3种四环素类抗性基因(tetA、tetB和tetC)为研究对象，研究了其在屠宰废水处理工程中各个环节的绝对含量和相对丰度变化情况，以期寻找到最佳的抗生素抗性基因处理工艺，为相关企事业单位优化设计污水处理工艺提供理论依据，为浙江省“五水共治”提供技术支持。
1材料与方法
1.1水样来源：水样样品来源于浙江中法农业科技发展有限公司屠宰废水处理工程，其工程按流程包括3000m3 厌氧沼气池、3600m3 潜流人工湿地、3600m3氧化塘和18hm2 表面流人工湿地等4个主要处理环节。按照废水处理流程选取了屠宰废水原水(即厌氧沼气池入水，采样点编号W1)、厌氧沼气池出水(即潜流人工湿地入水，采样点编号W2)、潜流人工湿地出水(即氧化塘入水，采样点编号W3)、氧化塘出水(即表面流人工湿地入水，采样点编号W4)、表面流人工湿地出水(即工程最终出水，采样点编号W5)等5个采样点，样品常温采集，保存于4℃环境，采样时间为2014年6月至2016年5月，每月下旬采样1次。
1.2实验试剂：TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffe、MgCl2、dNTP、DNAMarker、6×DNALoadingDye、10×TAE、土壤基因组DNA快速抽提试剂盒、溴化乙锭、柱式DNA胶回收试剂盒、一步法快速感受态细胞制备试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，以上均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。pMD 18-TVector，购于宝生物工程(大连)有限公司。引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.3试验仪器：洁净工作台、稳压稳流电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、微型电泳槽、PCR反应扩增仪、紫外分光光度计、微量移液器、3730XL测序仪、LightCycler480SoftwareSetup。
1.4试验方法：
1.4.1DNA抽提:依照土壤基因组DNA快速抽提试剂盒说明书操作。
1. 4.2标准品制备:
1.4.2.1普通PCR:PCR反应体系25μL：模板DNA0.5μL，引物F(10μmol/L)0.5μL，引物R(10μmol/L)0.5μL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，TaqBuffer(10×)2.5μL，MgCl2(25mmol/L)2μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，H2O18.3μL。反应条件为：预变性95℃ 3min;变性94℃30s，退火56℃ 30s，延伸72℃ 30s，修复延伸72℃ 8min，循环数35。
1.4.2.2：PCR电泳2% 琼脂糖凝胶，1×TAE，150V，100mA，20min电泳观察(图1)。
1.4.2.3PCR回收依照柱式DNA胶回收试剂盒说明操作。1.4.2.4克隆测序连接反应10μL：Solution5μL，pMD18-TVector10ng，PCRProduct5μL，4℃过夜连接。连接产物转化依照一步法快速感受态细胞制备试剂盒说明操作。质粒提取依照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒说明操作。
1.4.2.5定量质粒信息:构建好的质粒经测序鉴定无误后用紫外分光光度计测定质粒D260nm的值，通过公式换算成拷贝数(copies/μL)。10倍梯度稀释构建好的各质粒，90μL稀释液+10μL质粒，做4～6个点，通过预试验选取合适标准品用于制备标准曲线。
1.4.3荧光定量PCR检测反应体系见表1，
PCR循环条件见表2。完成后，把加好样品的96/384 孔板放在LightCycler480SoftwareSetup(Roche)中进行反应。
2结果与分析
由表3可见，5种抗生素抗性基因sul1、sul2、txtA，txtB和txtC在屠宰场废水原水中均有检出，其平均绝对含量分别为5.18×105、1.48×105、6.71×105、5.77×103 和9.77×105copies/L，5种抗生素抗性基因中sul1、sul2、txtA和txtC平均绝对含量较高，说明含有sul1、sul2、txtA和txtC基因的宿主菌较含有txtB基因的宿主菌对各种环境耐受力更强。本次屠宰废水抗性基因平均绝对含量与之前报道的养殖废水中含量相当，说明屠宰废水和养殖废水一样是抗生素抗性基因主要污染源之一。
2.1厌氧处理对5种抗生素抗性基因的绝对含量和相对丰度的影响:从厌氧池进出水中可见，水质中sul1、sul2、txtA，txtB和txtC5种抗生素抗性基因平均绝对含量均有所下降(图2、表3)，基于水量平衡计算可得5种抗生素抗性基因平均去除率分别为43.06%、28.35%、67.64%、31.65%和43.31%。但从5种抗生素抗性基因平均相对丰度分析(图3、表3)
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