从土壤腐殖质分组到分子有机质组学认识土壤有机质本质|研究

导读

本文系统梳理了与土壤生态系统功能相联系的，特别是对固碳减排的土壤有机质本质认识的研究进展及路径，探讨了经典腐殖质学说存在的问题，概述了新近的有机质保护稳定学说及腐殖质组学学说，并追溯了生物标志物有机质分子研究，最后从土壤学的基本理念和理论出发讨论和重新认识土壤有机质的本质及其价值。

经典土壤腐殖质学说及其存在的问题

1 土壤腐殖质组分与腐殖化过程

经典土壤学将土壤有机质定义为土壤中的生命体及其死亡的生物质残留和腐殖质。前者也可认为是非腐殖质，代表没有降解或者降解残留的植物源有机物质。腐殖质包括腐殖物质和非腐殖物质。经典土壤腐殖质理论认为腐殖物质包含3 个最基本和重要的组分：分子量较小而化学性质较活泼的富里酸，分子量较大且以杂环结构为特征的复杂胡敏酸以及高度缩合、惰性的胡敏素等。这些组分是土壤有机质中数量较多、性质稳定的复杂有机物质，其分子量可介于数百到数十万道尔顿（dalton），化学结构具有高度异质性。

土壤腐殖质形成理论先后有植物有机物降解假设、微生物合成假设、化学多聚化假设以及细胞自溶假设。经典腐殖质理论的核心是生物源有机物的腐殖化过程：新鲜有机质矿化—残余物二次合成—聚合与缩合—腐殖质形成。腐殖质合成的本质是以含氧芳香烃为核心，有机质降解中间产物与其聚合进一步合成大分子多聚体（往往称为二次合成），最终很可能以含氧芳香烃及其衍生物为基础，外接不同碳链的脂肪族烷烃分子而链接为巨大聚合物，这种大分子聚合体通过金属离子桥键结合到矿物表面，成为有机矿质复合体（被认为是腐殖物质的超分子结构本质）而稳定于土壤，使腐殖化过程具有了生态学意义。但这种聚合作用和桥接稳定作用的热力学过程还很不清楚，其反应并不符合能量降低规律，故不断受到土壤有机质研究者的质疑。

20 世纪90 年代以来，傅里叶变换红外光谱、核磁共振和热裂解—质谱仪等光谱/波谱/色谱学结合分析技术引入土壤有机质组分研究，使得人们在功能团组成上认识了土壤有机质的复杂性和多元性。

2 有机质分解与选择性残留保护学说

与腐殖质学说相交存在的另一种观点是，土壤有机质是植物来源有机物的残留物。20 世纪30 年代，已经有不同分解阶段的植物残留有机物的化学组成资料。到20 世纪末，对于土壤中不同植物来源有机分子的存在及其分解性已经有详尽的资料。这些未分解、部分分解和正在分解转化中的有机组分构成了瞬时的土壤有机质主体，且处于连续的动态变化中。之前研究认为，真菌促进了新鲜有机物分解而使其残留物成为土壤有机质。后来，这种有机质残留被认为是土壤微生物在完成分解后“选择性保留”于土壤的结果，是土壤微生物的“自私行为”。作为优先性分解组分，来自植物残体和叶片的有机物质快速分解损失，而来自根部的植物有机质倾向于保留在土壤中，使土壤表现出对根有机物的“偏好”（亲合性）。

腐殖化理论指向土壤有机质持留存在的终极机制是腐殖物质的分子化学稳定性，但不易被微生物矿化分解，成为抗性（refractory）有机质，特别是有机质损失而亏缺的农业土壤中残余的有机质部分。随着有机质的输入，不稳定组分首先被土壤中的微生物利用，而稳定性组分只有在不稳定组分消耗殆尽时才有可能被微生物利用，因而在土壤中更长期保存下来成为老碳，即微生物的“喜新厌旧”使土壤有机质总体上更新变慢。即使是这样，在森林土壤中，大分子的木质素化合物可能仍会选择性地保留在大土壤颗粒（数百微米的团聚体）中成为抗性组分，而农业利用下的抗性组分主要在细颗粒（例如粉粒/黏粒级复合体）中，其中选择性地保留了分解有机质产生的微生物多糖。腐殖物质化学稳定说曾在土壤学研究中盛极一时，还提出了多种操作方法（如6 mol/L HCl 提取组分法）用以表征土壤有机质特别是腐殖物质的化学稳定性。不过，在合适的条件下，特定的微生物区系对化学惰性明显的“腐殖物质”大分子化合物的分解可能比预想的更快，这看起来就像是土壤微生物遇到一个伴侣时的“兴奋互动”。

21 世纪以来，腐殖质组分抗微生物分解的内在（化学）稳定性经典学说越来越被诟病。有学者研究认为，腐殖质组分抗分解概念是模糊和抽象的，严重误导了土壤碳循环与气候变化的反馈研究，某些组分的固有抗分解性不是其分子性质所决定的，而是受到微生境条件下的生物可达性及/酶反应动力学的制约。腐殖质学说的化学结构稳定性不但在化学本质上受到质疑，在解释土壤有机质稳定机制上也日益显得苍白而难以为继。基于有机质物理化学本质的腐殖质学说可能误导了对土壤有机质过程以及生态系统碳循环的理解，需要新的角度和技术方法重新构建土壤有机质理论。这些认识进展已经反映在国外权威教科书《The Nature and Properties of Soils》第15 版对其第14 版中关于土壤有机质概念及其组成结构的修正上（图1）。

图1土壤有机质概念及组成认识的演变

腐殖质组学（Humeomics）学说及其方法

应用检测技术进行物质结构分析的前提是待测物质中组分组成尽量富集或单一纯净。“腐殖质”成分的复杂性并不能满足各组分的分子结构鉴定。为细致地研究腐殖质各组分的分子组成，模拟腐殖质由单一的简单组分与土壤物质形成不同结合力的复杂组分，采用模拟结合力的有机提取剂分离特定的腐殖质组分一直是腐殖质学说坚守者的努力方向。2011 年Piccolo 团队首次提出了“腐殖质组学（Humeomics）”概念及其方法框架。腐殖质组学是基于有机溶剂萃取的连续性分离法，通过与三氟化硼在甲醇体系中的酯交换、甲醇的碱性水解、使用HI 裂解醚和糖苷键合等一系列反应，土壤中不同结合状态的有机分子被连续提取和释放，通过气相色谱鉴定反应释放出的腐殖质组分分子，最后表征土壤腐殖质的分子组成结构和特点（图2）。这种腐殖质组学法分离得到的有机组分可以偶联于核磁共振波谱分析、气质联用分析和电喷雾静电场轨道阱组合式高分辨质谱联用分析系统（ESIOrbitrap-MS），从而获得高分辨率的腐殖质分子组成信息。

图2 土壤腐殖质组学的连续提取分离法程序框架

这套方法体系在传统的腐殖质碱提取法基础上，试图将所有土壤有机质组分能连续地分离纯化，继而通过有机组分的高分辨率分子鉴定来详细解析各分离组分的腐殖质分子组成，以获得比传统碱提取技术更多的分子组成信息。然而，基于土壤胡敏酸的腐殖质组学组分所获得的分子组成，并不能表征全部土壤有机质分子组成信息。为此，有学者提出了修正的提取分离方法程序（图2），代替上述方法中对胡敏酸的提取。改进后的腐殖质组学技术能够直接应用于原始土壤样品，可最大程度地提取和分离出更多的土壤有机质组分，获得令人满意的土壤有机质总回收率。不但获得了第一个游离态水溶性（其实是弱酸溶性）组分（AQU1），并对残留组分进行进一步分离，获得了更多的土壤有机质组分分子组成信息，继而通过不同组分的质量组成及其比例（图3），可以探究土壤中不同组分对总有机质的贡献。

图3 腐殖质组学分离鉴定法获得的某水稻土土壤有机质组分VanKrevelen 图

生物标志物分子与土壤有机质分子组学的萌生

1 植物生物标志物与植物源有机质分子鉴定

直至20 世纪末，生命特征化合物（分子）鉴定技术不断成熟，并逐渐用以探究土壤有机质的本质。了解有机质分子分布，需要辨析生命来源的有机物随着分解的分子变化。在正常土壤中，土壤有机质来源于植物残体、根系及其分泌物，以及土壤微生物生物体及其代谢产物。这些是不同分子大小和碳结构的多糖、单宁、蜡质、脂类、木质素和蛋白质等类群的有机物质。土壤中存在的这些有机物质可能因来源和降解程度的差异在分子结构及碳链长度上带有特定生命信息，称为有机质的分子生物标志物（biomarker molecules）。鉴定这些分子的丰度和组成，可能为探索土壤有机质生命来源、追溯生态系统演变提供了一种新的技术途径。

植物来源的脂类物质和木质素可稳定存在于土壤中，角质（cutins）和木栓质（suberins）中不同碳链长度分子的组成或特定分子的比例常用来研究土壤中有机质的植物来源及其降解程度。作为导管植物的生物大分子，木质素降解的特征单体包括香兰基（Vanillyls，代号V）、丁香基（Syringyls，代号S）和肉桂基（Cinnamyls，代号C），常用作木本生物标志物。丁香基/香兰基值（S/V）和肉桂基/香兰基值（C/ V）常用于推断土壤中木质素来源的植被类型和量化不同植被来源的有机质对土壤碳库的贡献，因而可指示土地利用变化导致的有机质组成变化。

角质素化合物是非晶态的大分子生物共聚酯，其成分主要是羧酸（n-alkanoic acids）、中链羟基烃酸（chain ω-hydroxy-alkanoic acids）和C16单/双羟基酸，并含有一定数量以酯键结合的环氧基团。木栓质化合物则主要来自于植物的根系和树皮，包括脂肪族聚酯、多酚类化合物以及长链羟基烃酸（链长度≥C20）。角质/木栓质替代脂肪酸（suberin/cutin-derived substituted fatty acids，Biomarkers-SFA）是相对稳定的植物源生物标志物，在C3与C4植物下，土壤有机质中20~30 个碳长度的中长链羧酸（如n-C22，n-C24和n-C26）分布模式迥异，因而可以用来探讨植物地下部/地上部的有机质来源。

木栓质中的脂肪二酸（di-acids）来自单子叶植物根系，常作为农作物植物根系生物标志物（rootbiomarker）。而角质，特别是其中的链羟基羧酸（-chain hydroxy carboxylicacids）来自地上部茎叶组织，常作为地上部生物标志物（shoot biomarker）。作为土壤中稳定的植物源有机化合物，检测这些替代性脂肪酸的相对丰度，可以区分根和叶片对土壤有机质的输入和稳定，并评估植物地上和地下部对土壤有机质的贡献。目前为止土壤有机质分子组成研究中报道的生物标志物及其鉴定综合展示于表1。

表1 土壤有机质中可鉴定的生物标志物特征与源解析

2 从探析碳固定机制到探究土壤有机质的生命起源本质

以往分子有机质研究多是采用固态红外光谱或者固态核磁共振波谱直接对土壤样品进行有机质官能团组成分析。而对颗粒态有机质或者溶解性有机质的分子分析需进行提取制样，结合气质联用分析可以达到定量表征的要求；近年来，基于质谱—气质联用技术的静电场轨道阱组合式质谱分析、热解吸气质联用、傅立叶变换回旋共振质谱，构成了土壤有机质波谱化和定量化分析方法，获得高分辨率有机质组成分子信息这些高分辨率技术可以用于土地利用及管理变化下，外源有机物质进入土壤后的去向及其固定途径的解析研究。

通过近10 多年来的发展，湿化学法结合气相色谱—质谱联用仪法，即土壤中植物标志物提取—萃取—浓缩法及GC/MS 定性/定量鉴定法联合技术已经基本完善，可满足土壤有机质生命来源分子的追踪。

在生态系统中，无论来自地上部还是地下部生物生命活动留下的残余物或者代谢产物，在土壤中随时随地处于不同程度微生物接触而降解的过程，因此瞬时的土壤有机质应该是所有曾经及正在土壤中活动的生命代谢产物或有机体残余，仅是不同程度微生物降解的化合物的集合，构成了土壤有机质系统。不同土壤所处生态系统演替过程各异，作为有机质输入来源的植物种类及其比例差异在不同生态系统土壤中差异很大，欧洲学界将此抽象为腐殖质系统及其形态类型（humus system and forms）。故而任何一种土壤中，植物天然生物标志物分子丰度及组成都可能反映特定系统的土壤有机质特点，更可以用来追溯有机质来源或者生态系统演化历程。

面向土壤有机质组学的土壤有机质研究

土壤中有机质是一系列既处于不同分解阶段又结合或保护于不同粒径团聚体生命来源的有机分子集合。考虑到有机物质的分解程度和微生物参与分解的区系序列，分解程度较低的生物大分子和主要参与初期分解的真菌及其残体多存在于粒径较大的团聚体，而充分降解释放的较小分子以及主要参与后期分解的细菌及其残留物趋向于向较小团聚体集中。团聚体结构中土壤微域生境多样性，可能赋予了土壤有机质的分子多样性与微生物区系及种群的多样性。在本体土壤中，团聚体是连续的，因而土壤中有机分子分布以及相应的微生物分布都是土壤中连续分布的整体。

从本源上说，土壤物质就是大小、结构和功能（反应性和生物活性）不同的、矿物质—有机质—微生物有序集合的土壤团聚体颗粒集合。其形成、发育和稳定属于土壤的生物动力学过程（biodynamics），是土壤形成及相关生命过程的基础。植物等生物活动剩余物输入的有机物质，一方面作为原始材料驱动土壤有机质形成和稳定；另一方面，它们被土壤中的食物网，特别是微生物分解利用，并提供其活动的能源。而土壤团聚体的形成、稳定和更新提供和维持了有机质—微生物—生物功能的偶联关系及其稳定，是土壤发挥生物地球化学作用和生物多样性保持的根本。因此，土壤有机质连续体实际上是一种保持有机质—微生物—生物活性良好协同的微域机制框架。

土壤有机质一直是土壤学研究中的一个物质黑箱，从定性到定量认识土壤有机质的本质及品质的研究经久不衰。从生物质炭土壤改良和秸秆炭基肥的生态农业试验得到启示，土壤有机质发挥着以下功能：①结构建成功能，作为可塑有机构件（building blocks）参与形成矿质—有机复合体和土壤团聚体。② 反应性功能，即通过包被矿物质表面，修饰了土壤的颗粒表面，呈现出氧化还原活性、可变电荷的吸附活性以及对无机元素的螯合和对有机化合物的捕获固定活性。③生物激活功能，既刺激土壤生物（包括根系）代谢活动的功能，也包括可矿化有机质对土壤微生物的激发效应。最近关于生物质炭可提取有机质对植物生长的效应研究，进一步明确至少部分土壤可溶性有机物可以刺激植物生长，促进植物生长与健康，进而对植物病害具有抵御作用（system resistance），尽管这种效应还可能是由于这些活性有机质所具有的氧化还原（电子迁移）活性。

表征和认识土壤有机质的本质，首先是探析生态系统中伴随土壤形成和发育的生命活动足迹（不同生物起源有机分子的丰度和结构），其次是土壤中有机质与生命多样性保持的关系（如有机质分子保持与土壤生物选择性适应及利用的关系），最后才可以揭示土壤有机质的土壤功能与生态系统服务（如土壤固碳）。鉴于土壤是陆地最大的生物多样性储库且食物多样性是食物链多样性的基础，土壤有机质将具有比微生物更大的多样性。因此，土壤有机质质量至少应该与土壤微生物的食物多样性和土壤团聚体稳定性相联系，这也从生态学角度提示了有机质分子研究的重要性。我们认为，土壤有机质在土壤中不仅是连续体，而且作为土壤核心的团聚体—有机质—微生物—生命活动的耦合结构，亦应呈连续体的分布系统（图4），特别是在长期发育演化而稳定的土壤中。在这方面，近10 年来欧洲学术界对土壤腐殖质系统与腐殖质形态的大陆尺度的对比和整合研究，有可能对土壤与生命发育的关系提供更前沿的视角。这对未来分子有机质的研究和认识具有重要的借鉴作用。

图4 土壤有机质组分及其结构—组成—功能联系的连续分布概念框架

随着土壤微域鉴定技术和Nano-SIMS 的应用，可视化和原位化的土壤团聚体生物物理结构的重现成为可能。结合土壤团聚体的非干扰分离制备技术，土壤有机质分子组成与土壤团聚体物理结构的耦合发育可能构建土壤有机质的分子序列，并逐渐成熟为团聚体—有机质—微生物—酶活性等要素的分子组学。配合业已成熟的酶活性组学技术（Zymography），这种有机质组学技术将可能回答土壤学的关键问题：如何解析作为连续体的土壤有机质分子大家庭的基本构成与存在状态，如何表征其与土壤的团聚体结构、微生物区系结构及其生态系统功能活性的联系，如何刻画和鉴别不同生态系统、不同利用和管理下土壤有机质的差异，如何建立土壤可持续管理的土壤分子有机质本质及品质。纵观当今的土壤学研究，土壤腐殖质学说已不能适应土壤有机质过程和功能的认识，特别是土壤与生命耦合协同关系的探索；腐殖质组学虽然理论框架和方法基本成型，但其对土壤有机质的存在状况及其与生命过程的联系尚存疑隙；土壤有机质分子研究已经走出萌芽阶段，借助于现代高分辨率分子分析技术，已经凸显为新时期全球土壤基础研究的新兴领域。

结语

土壤有机质研究一直处于“黑箱”中，随着其含量、组成、结构和功能的土壤学研究的深入和有机分子分组、分离、监测和定量等有机化学分析技术的提升，剖析土壤有机质的丰度、组成、结构及其生物活性的条件日益成熟，有机质研究已经抵近“白箱”。以有机质的分子组成为基本线索，以有机质的结构和功能为焦点，以有机质的本质和品质为诠释目标的土壤有机质分子组学将成为土壤学最核心的基础理论研究方向。这方面的创新知识不但充实或提升了土壤学核心理论，并将提升土壤学服务可持续固碳和管理以保持土壤自然价值的支撑能力。期望我国能够迎头赶上，并努力树立优势和特色，在国际土壤学前沿发展中做出应有的贡献。