冠状病毒在水和废水中的存活

将出水(30mL)加入到无菌的50mL聚丙烯离心管中。在添加病毒之前，一级出水通过0.2μm孔径的过滤器过滤，并且未经过滤的也进行测试。二级出水仅未经过滤的进行测试。然后将病毒添加到每个离心管中，最终浓度为105 TCID50/mL。将离心管涡旋，立即取样(零时间点)。然后将离心管覆盖并保持在室温(23℃)。在1、2、3、6、10、15和21天后收集样品，并将样品在-80℃下冷冻直至分析。

使用噬斑试验或TCID50技术在细胞培养物上计数病毒。在6孔塑料细胞培养板中，通过噬斑测定法(Payment and Trudel 1993)测定了PV-1的效价。这是一种直接定量方法，最低检测限为10 pfu/mL。

将每种稀释液接种在两个孔中。在细胞培养中不形成斑块的冠状病毒，通过组织培养感染剂量50%技术(TCID50)在24孔塑料细胞培养板中测定其效价(Payment and Trudel 1993)。这种技术确定了显示出CPE的50%的原液的稀释度。取稀释倍数的反对数，得到每毫升TCID50的病毒效价。

该方法的最低检测值为每毫升3.7个病毒。将每种稀释液接种在至少8个孔中。在添加病毒之前，任何来自测试水的样品都必须在细胞培养检测之前过滤，以消除细菌污染。在pH为7下使3%牛肉提取物(Becton Dick-inson，Sparks，MD)通过以阻断可能吸附病毒的位点来制备具有聚醚砜(PES)膜的0.2 μm低蛋白结合Millex过滤器(Millipore, Billerica, MA)。所有实验重复三次。

03结果和讨论

表1显示了三种病毒在测试水中的存活天数。每种病毒的对数减少量由公式“lg N/N0”计算，其中N是指定日期的病毒效价，N0是时间为0的病毒效价。线性回归的斜率用于确定存活率；病毒效价下降99%和99.9%所需的时间(分别表示为T99和T99.9)。

影响病毒在水中存活的因素包括温度、有机物和好氧微生物(John and Rose 2005; Melnick and Gerba 1980; Sobsey and Meschke 2003)。对病毒存活最关键的影响因素就是温度。已有研究表明，病毒存活率随着温度的升高而降低，这主要是由蛋白质变性和胞外酶活性增加引起的(Hurst et al. 1980; John and Rose 2005)。自来水研究的结果证实冠状病毒就是这种情况。通过测试过滤后的自来水，我们减少或消除了颗粒有机物和细菌的影响。

在室温下，只需要10天就能使过滤后的自来水中的冠状病毒减少99.9%，而在4℃时，这种程度的病毒灭活则需要100天以上。PV-1在自来水中4℃的存活与冠状病毒相似，但在室温(23℃)下，该病毒在过滤水和未过滤水中的存活时间都延长了六倍。

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