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6.30 硅胶:0.063 mm~0.212 mm(230 目~70 目)。
在烧杯中用甲醇(6.1)洗净,甲醇挥发完全后,在蒸发皿中铺开,厚度小于 10 mm。 130°C 下干燥 18 h 然后放入干燥器冷却 30 min,装入试剂瓶中密封,保存在干燥器中。
6.31 20%的硫酸硅胶。
取硅胶(6.30)80 g,加入硫酸(6.11)20 g,充分振荡后变成粉末状。将所制成的硅胶装入试剂瓶密封,保存在干燥器中。
6.32 33%的硫酸硅胶。
取硅胶(6.30)67 g,加入硫酸(6.11)33 g,充分振荡后变成粉末状。将所制成的硅胶装入试剂瓶密封,保存在干燥器中。
6.33 活性炭:可使用市售成品,也可选用下述方法配制。
将经过处理的活性炭 1 g 与 99 g 的硅藻土(6.28)在 500 ml 玻璃瓶(需具有聚四氟乙烯内衬螺帽)中混合均匀,贮于干燥箱内保存备用。
6.34 铜粒(粉)。使用前用盐酸(6.10)清洗,去除表面的氧化物后,用水清洗并干燥。
6.35 石英棉:200°C 下处理 2 h,密封保存。
6.36 微孔板:底部透明、经灭菌后的微孔板。
6.37重组细胞:经过重组的肝癌细胞(人类、小鼠、天竺鼠),重组系列包括二噁英响应原件、基础启动子以及下游的荧光素酶报告基因。
7 仪器和设备
7.1 提取装置:索氏提取器、自动索氏提取装置、加速溶剂萃取仪或快速溶剂萃取仪等装置。
7.2 浓缩装置:旋转蒸发装置或者平行蒸发装置、氮吹仪等性能相当的设备。
7.3 多通道移液器:8 通道或 12 通道移液器。
7.4 细胞计数器。
7.5 CO2 细胞培养箱:饱和湿度、温度为 37°C、CO2 浓度为 5%。
7.6 离心分离机:转数可达 3 000 rpm ~4 000 rpm。
7.7 生物安全柜:II 级 A 型。
7.8 倒置显微镜:可放大 10 倍、40 倍或 100 倍。
7.9 酶标仪。
7.10 真空泵。
7.11 搅拌器。
7.12 微孔板振荡器。
7.13 恒温槽:温度控制在 30℃~50℃。
7.14 一次性巴斯德移液管。
7.15 移液管:5 ml 和 10 ml。
7.16 培养瓶(皿):25 cm2、75 cm2 和 150 cm2。
7.17 移液器吸头:10 µl、20 µl、200 µl 和 1 000 µl。
7.18 液氮贮存罐:保温性能均一、工作液氮量、静态蒸发速率必须满足相关规定的产品。
7.19 高压蒸汽灭菌器:器内压力 196 kPa,蒸汽温度 121°C 以上,或者相同品质的产品。
7.20 细胞冻存管。
7.21 超低温冰箱:温度可到-80°C。
7.22 一般实验室常用仪器和设备。
8 样品
8.1 样品采集和保存
按照 HJ/T 20 和 HJ/T 298 的相关规定进行固体废物样品的采集和保存。
8.2 样品的制备
8.2.1 固态样品
固体样品的制样方法参照 HJ/T 20 执行。工业固体废物和危险废物焚烧处理后的灰渣和飞灰,经风干和粉碎研磨处理以减小样品的粒度。用机械方法或人工破碎和研磨,筛分,使95%的样品粒径达到 2 mm 以下。样品经混合及缩分后制成分析用样品。
8.2.2 液体样品
液体样品制样时,应充分混均并缩分。样品混均采用人工或者机械搅拌方法进行。样品混均后,采用二均法,每次减量一半,最终样品量为检测分析用样品量的 10 倍左右。
8.2.3 半固态样品
半固态样品制样时,样品经自然风干后,采用人工或者机械方法破碎和研磨,筛分,使95%的样品粒径达到 2 mm 以下。样品经混合及缩分后制成分析用样品。半固态样品在制样时,应同时测定含水率。
8.3 试样的制备
8.3.1 提取
8.3.1.1 固态样品的提取
称取一定量制备好的固态样品,添加盐酸(6.10),添加量为每 1 g 固态样品添加 20 ml。
搅拌固态样品,并观察发泡情况,必要时再添加盐酸(6.10),直至不再发泡为止。用布氏漏斗过滤盐酸处理液,并用水充分冲洗固态样品,再用少量甲醇(6.1)或者丙酮(6.2)除去水分。将玻璃纤维滤膜和固态样品放入烧杯中干燥。盐酸处理液采用二氯甲烷(6.5)萃取,添加量为每 1 L 处理液添加 100 ml 二氯甲烷(6.5),振荡萃取,萃取液采用无水硫酸钠(6.25)脱水,重复三次上述操作。以甲苯(6.3)为溶剂,将充分干燥后的玻璃纤维滤膜和固态样品进行 19 h 以上的索式提取或者性能相当的提取设备进行提取操作。将二氯甲烷萃取液和甲苯提取液混合作为该固态样品的提取液。
8.3.1.2 液态样品的提取
8.3.1.2.1 水溶性样品
称取一定量混合均匀的样品,按照每 1 L 样品添加 100 ml 二氯甲烷(6.5)(或者甲苯(6.3))的比例,进行振荡萃取,萃取液采用无水硫酸钠(6.25)脱水,重复 3 次萃取,作为该液态样品的提取液。
8.3.1.2.2 油状样品(含油淤泥、化学反应釜脚)
称取一定量的油状样品于烧杯中,然后添加 50 ml 甲苯(6.3),搅拌使可溶成分完全溶解。用布氏漏斗和玻璃纤维滤膜过滤甲苯处理液。将玻璃纤维滤膜和不溶性残渣放入干燥器中干燥。将甲苯处理液中的水溶性成分分离,加入二氯甲烷(6.5)(或者甲苯(6.3))(添加量可参考 8.3.1.1),振荡萃取,萃取液过无水硫酸钠(6.25)脱水,重复 3 次。以甲苯(6.3)为溶剂,将干燥完毕后的玻璃纤维滤膜和不溶性残渣进行 19 h 以上的索式提取或者性能相当的提取设备进行提取操作。将二氯甲烷萃取液和甲苯提取液混合作为该液态样品的提取液。
8.3.1.3 DMSO 萃取法
若提取液中含有油脂,可以使用以下 DMSO 萃取法,去除低极性的碳氢化合物后,再进行 8.3.3 的净化步骤。
8.3.1.3.1 在分液漏斗中加入 25 ml DMSO(6.7),并用正己烷(6.4)饱和,将浓缩至 1 ml的提取液加入分液漏斗,用少量正己烷(6.4)清洗,并将清洗液也加入分液漏斗,振荡萃取,静置分离 DMSO(6.7)层。重复上述操作四次,共得到约 100 ml DMSO(6.7)溶液,将其移入新的分液漏斗中,加入 40 ml 正己烷(6.4),振荡萃取,静置分层,弃掉正己烷(6.4)层。向分液漏斗中加入 75 ml 正己烷(6.4)和 100 ml 水,振荡萃取,静置分层,重复 3 次,得到约 225 ml 正己烷萃取液。
8.3.1.3.2 将氢氧化钾(6.26)配制成 2 mol/L 的水溶液。将正己烷萃取液移入新的分液漏斗中,添加 2 mol/L 的氢氧化钾水溶液 10 ml,振荡洗涤,然后再加入 25 ml 水洗涤,静置分层,正己烷萃取液经无水硫酸钠(6.25)脱水后进行下述实验。
8.3.2 浓缩
将萃取后的溶液浓缩至 1 ml,待净化。
8.3.3 净化
8.3.3.1 根据使用细胞的不同而选择与之相对应的净化方法。以下是两种细胞所对应的净化方法。
根据样品中二噁英类预测浓度的高低,分取 25%~100%(整数比例)的提取液作为测试溶液,剩余样品转移至棕色密封贮液瓶中冷藏贮存。
8.3.3.2 硅胶柱-活性炭柱净化
8.3.3.2.1 硅胶柱的填充与制备
将洗净的硅胶柱底部塞好石英棉(6.35),依次填充无水硫酸钠(6.25)1.5 g、33%的硫酸硅胶(6.32)4.0 g 以及无水硫酸钠(6.25)1.5 g,如图 1 所示。加入正己烷(6.4)30 ml预淋洗硅胶柱。
8.3.3.2.2 活性炭分离柱的填充与制备
将洗净的活性炭分离柱底部塞好石英棉(6.35),依次填充无水硫酸钠(6.25)0.4 g、活性炭(6.33)0.4 g、以及无水硫酸钠(6.25)0.8 g(图 2)。依次使用丙酮(6.2)5 ml、甲苯(6.3)20 ml、正己烷(6.4)10 ml,进行预淋洗活性炭柱。
8.3.3.2.3 硅胶柱-活性炭柱的净化
将硅胶柱与活性炭柱串联。然后将样品缓慢添加到串联柱上。添加正己烷(6.4)2 ml于样品瓶中,超声洗净样品瓶,将溶液加入到分离柱。添加正己烷(6.4)1 ml 于上述样品瓶中,进行上述同样的操作。采用 10 ml 正己烷(6.4)淋洗串联柱。取下硫酸硅胶分离柱。向活性炭柱中加入正己烷(6.4)10 ml,洗净活性碳柱。加入 DL-PCBs 淋洗液(6.12)15 ml,淋洗出 DL-PCBs 组分。加入甲苯(6.3)20 ml 淋洗出 PCDD/Fs 组分。 8.3.3.3 多层硅胶柱净化
8.3.3.3.1 多层硅胶柱的填充与制备
将洗净的硅胶柱底部塞好石英棉(6.35),依次填充 33%的硫酸硅胶(6.32),15 g、20%的硫酸硅胶(6.31)15 g、高度为 1 cm 的无水硫酸钠(6.25)。加入正己烷(6.4)40 ml 预淋洗硅胶柱。
8.3.3.3.2 多层硅胶柱的净化
将样品缓慢添加到多层硅胶柱上。添加正己烷(6.4)2 ml 于样品瓶中,超声洗净样品瓶,将溶液加入到分离柱。添加正己烷(6.4)1 ml 于上述样品瓶中,进行上述同样的操作。采用 60 ml 正己烷(6.4)淋洗多层硅胶柱,淋洗下来的溶液为 DL-PCBs 组份和 PCDD/Fs 组份。
8.3.3.3.3 其他净化方法
可以使用凝胶渗透色谱(GPC)、高压液相色谱(HPLC)、自动样品处理装置以及其他净化方法或者装置进行样品的净化处理。使用其他净化方法之前应用标准样品或者标准溶液进行分离效果验证,并确认是否与使用的细胞相适应以及是否满足本方法规定的质量控制/质量保证要求。
8.4 试样的保存
将上述净化后的溶液浓缩或者平行蒸发充分除去溶剂。保存时使用的溶剂根据使用细胞的种类不同而不同,以 H1L6.1C2 细胞为例,需加入 4 ml 正己烷(6.4)定容,超声 2 分钟,转入棕色瓶中,然后将试样放入冰箱中 4°C 保存。
8.5 操作空白样品的制备
以相同量的石英砂(6.29)代替样品,分别进行 8.3 和 8.4 的操作以制备操作空白样品。
8.6 细胞的管理
8.6.1 细胞的复苏
从液氮贮存罐(7.18)中取出细胞冻存管(7.20),将细胞冻存管(7.20)放入 37°C 水浴中快速融化,利用移液管(7.15)把细胞液转移到离心管中,离心分离机(7.6)离心速率设定 500 转/min,离心 10 min,(转数和离心时间的设定根据使用细胞的种类不同而不同),除掉培养基(6.16)。使用移液管向装有细胞沉淀的试管中加入新培养基(6.16),通过移液管搅拌使细胞悬浮。将细胞悬浮液转入培养皿(7.16)中,然后放入 CO2 细胞培养箱(7.5)中进行培养。
8.6.2 细胞的传代
当培养皿(7.16)中的细胞长满 90%时,将其从 CO2 细胞培养箱(7.5)中取出,放入生物安全柜中(7.7)。用 1 ml 磷酸盐缓冲溶液(6.18)(加入的体积根据培养皿表面积的不同而不同,此处以 25 cm2 为例)清洗,然后加入胰蛋白酶溶液(6.17)0.5 ml 润洗,静置 2 min,用手轻轻敲打培养皿外壁使细胞剥离,将剥离的细胞转移至离心管离心,吸走上清液,加入一定量培养基(6.16),使细胞悬浮并充分混匀后,取其中的一部分,加入到新的培养皿(7.16)中。将新的培养皿(7.16)放到 CO2 细胞培养箱(7.5)中继续培养。
8.6.3 细胞的冻存
经过几次传代后,如果细胞的状态达到最佳状态,则必须对细胞进行冻存,以留备份。按照 8.5.2 操作,直至细胞悬浮液制备完毕。对细胞进行计数,离心,去掉培养基(6.16),添加细胞冻存液(6.19),使其密度达到冻存要求(根据使用细胞的不同而不同),装入细胞冻存管(7.20)中。将细胞冻存管(7.20)做好标记后,放入程序降温盒(程序降温盒使用之前,里面加异丙醇(6.9)至刻度线,恢复至室温,内部保持干燥),将程序降温盒放入超低温冰箱(7.21)至 4 h 以上,然后转移至液氮贮存罐(7.18)中长期保存。
9 分析步骤
9.1 仪器参考条件
设定测定化学发光模式,波长 300 nm ~900 nm;终点法。
9.2 校准
9.2.1 仪器校准
打开酶标仪(7.9)预热 15 min,按照 9.1 设定参考条件,将仪器自带的校准专用版放入酶标仪进行自动校准,根据测定结果评估仪器是否达到要求。
9.2.2 标准曲线的绘制
9.2.2.1 报告基因法标准曲线的建立一般采用四参数方程或者直线回归方程,下以四参数方程为例说明标准曲线的具体建立过程。
9.2.2.2 四参数 Hill 公式按照公式(1)进行计算:
式中:Y—化学发光值,RLU;X—标准溶液浓度,pg/ml;TOP—最大化学发光值,RLU;Bottom—最小化学发光值,RLU; EC50—RLU 达到一半时标准溶液的浓度,pg/ml;HillSlope—斜率变量。
9.2.2.3 将 DMSO(6.7)配制的不同系列的 2, 3, 7, 8-TCDD 标准溶液(6.24),按照标准方法操作,得出 RLU,带入理论式,使用软件计算,进行 4 参数 TOP、Bottom、EC50、Hillslope的优化(使理论的 RLU 和实测的 RLU 之间偏差的 2 次方最小),从而得出四个参数:TOP,Bottom,LogEC50 和 Hillslope。将得出的 4 参数带入上述方程,得到四参数方程。
9.3 试样测定
9.3.1 样品的测定过程以使用细胞的不同而不同,下以 H1L6.1C2 细胞为例。
9.3.2 决定稀释倍数的实验
9.3.2.1 将计数完毕后的细胞悬浮液,进行稀释,使其浓度达到 7.5×105 个/ml。
9.3.2.2 准备微孔板(6.36),其边缘孔不加细胞,每孔加 100 µl 水或者 PBS(6.18),中间总
共 60 个孔添加细胞悬浮液(横 10 纵 6),每个孔各添加 200 µl。
9.3.2.3 将添加完毕后的微孔板(6.36)放入 CO2 细胞培养箱(7.5)中,进行 24 h 培养。
9.3.2.4 测定液配制过程
9.3.2.4.1 溶液的分取
a) 测定用样品的分取
1) 在玻璃试管中加入二甲基亚砜(6.7)2 µl。
2) 从 4 ml 的样品瓶中分取适量的样品,一般二噁英类组分稀释的比率为 20、200和 2 000。
b) 绘制标准曲线用标准溶液(6.24)以及质控(QC)(STD 5)溶液的分取
1) 将配制好的标准溶液(6.24)以及 QC 溶液,分别添加 4 µl 到试管中。
2) 在玻璃试管中加入二甲基亚砜(6.7)4 µl,将此作为阴性对照溶液(NC)。
9.3.2.4.2 加入正己烷(6.4),将样品定容为 0.5 ml,标准溶液(6.24)、QC 溶液以及 NC 定容为 1 ml。
9.3.2.4.3 将试管放入浓缩装置(7.2)中进行浓缩近干。每隔 2 min,对玻璃试管内的正己烷(6.4)的残余量进行确认。
9.3.2.4.4 平行蒸发完毕后,在样品试管中加入培养基(6.16)200 µl,在装有标准溶液(6.24)、 QC 溶液以及 NC 溶液的试管中加入培养基(6.16)400 µl,用搅拌器(7.11)进行 10 sec 左右的搅伴。
9.3.2.5 将培养了 24 h 的微孔板(6.36)取出,将培养基(6.16)去掉,对细胞的状态进行确认,如果发生异常,则做好记录,同时追查原因,如果影响后续的测试结果,则将整盘细胞弃掉,重新培养细胞,如果确认无误,则进行下面的实验。
9.3.2.6 将 190 µl 已经稀释完毕后的样品添加到微孔板(6.36)上,标记好微孔板(6.36)后,将其放入 CO2 细胞培养箱(7.5)中进行 20~24 h 的培养。
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5月16日,生态环境部公开征求《全面实行排污许可制实施方案》(征求意见稿)的意见,《实施方案》(征求意见稿)中提出,到2027年,固定污染源排污许可制度体系更加完善,全面管控主要污染物排放量,建成以排污许可制为核心的固定污染源监管制度体系,排污许可“一证式”管理全面落实,固定污染源排污
5月15日,生态环境部、江苏省人民政府联合在江苏常州举办2024年“全国低碳日”主场活动。活动中,生态环境部正式揭晓2023年绿色低碳典型案例获选名单。为进一步提升全社会绿色低碳意识,生态环境部在2023年“全国低碳日”主场活动中启动了系列典型案例征集活动。活动共收到31个省(区、市)、新疆生产
气候变化是全人类共同面临的严峻挑战。作为易受气候变化不利影响的最大发展中国家,气候变化已经成为建设美丽中国和推进中国式现代化进程中的重要风险,主动适应气候变化是当前面临的现实而紧迫的任务。为全面反映贯彻落实党中央、国务院决策部署和推动实施《国家适应气候变化战略2035》的情况,增进各
生态环境部发布2023年绿色低碳典型案例获选名单。5月15日,生态环境部、江苏省人民政府联合在江苏常州举办2024年“全国低碳日”主场活动。活动中,生态环境部正式揭晓2023年绿色低碳典型案例获选名单。为进一步提升全社会绿色低碳意识,生态环境部在2023年“全国低碳日”主场活动中启动了系列典型案例
近日生态环境部发布了关于2024年第4批新化学物质环境管理常规登记证申请审查情况的公示,共11份新化学物质环境管理常规登记申请材料。详情如下:关于2024年第4批新化学物质环境管理常规登记证申请审查情况的公示根据《新化学物质环境管理登记办法》(生态环境部令第12号,以下简称《办法》),我部对芬
近日,生态环境部等多部门发布深化气候适应型城市建设试点名单,共39个市(区),详情如下:关于印发深化气候适应型城市建设试点名单的通知各省、自治区、直辖市及新疆生产建设兵团生态环境厅(局)、财政厅(局)、自然资源主管部门、住房城乡建设厅(委、局)、交通运输厅(局、委)、水利(水务)厅
5月13日,生态环境部部长黄润秋主持召开部常务会议,审议并原则通过《生活垃圾填埋场污染控制标准》、《2023中国生态环境状况公报》,以及41种化学物质增补列入《中国现有化学物质名录》。生态环境部党组书记孙金龙出席会议。会议指出修订《生活垃圾填埋场污染控制标准》是适应新的环境管理需要,强化
生态环境部发布国家生态环境标准《地表水水质自动监测站选址与基础设施建设技术要求(征求意见稿)》,本标准规定了地表水水质自动监测站选址、站房与采水单元等基础设施建设和验收等技术要求。适用于地表水水质自动监测站站址选择、基础设施建设和验收工作。
5月10日,中国人民银行、生态环境部、金融监管总局、中国证监会联合召开绿色金融服务美丽中国建设工作座谈会,传达学习党中央、国务院关于全面推进美丽中国建设的总体部署,交流金融支持绿色低碳发展和美丽中国建设有关经验做法,研究部署下一阶段工作。中国人民银行党委书记、行长潘功胜,生态环境部
2024年5月7日,生态环境部对外合作与交流中心(以下简称中心)与山东省生态环境厅(以下简称山东省厅)战略合作协议签署仪式在山东济南举行。根据协议,双方将在打造国际公约履约创新示范区、开展生态环境国际交流合作、推进减污降碳协同创新、助力美丽山东建设等方面开展务实合作。侯翠荣厅长对田成川
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