AO工艺处理淀粉污水效能及微生物群落解析

随着我国工业化进程的不断加快，工业废水排放量也日益激增，其对水环境的影响程度已不容忽视。特别是高浓度氨氮废水的超标排放，极易造成自然水体富营养化，出现水华和赤潮现象。生化处理是现今应用最广、最经济的污水处理方式，常见工艺包括以活性污泥法为基础的AO，A2/O和MBR等。活性污泥内部微生物在代谢分解污染物时，一方面将污染物中的碳氮物质用于自身生长，另一方面，与其他生物共同组成较为稳定的微生态系统。因此，活性污泥中微生物多样性的研究对优化处理工艺具有重要意义。

然而，由于传统分子生物学技术的限制，分离培养法只能鉴别不足1%的微生物，难以揭示活性污泥中微生物的群落结构和生长机制。近年来，随着分子生物学技术的发展，具有通量高、成本低、灵敏度高、流程自动化等优势的高通量测序技术已广泛应用于污泥微生物的研究，并且在揭示水处理工艺功能菌群方面发挥了重要作用。AO工艺作为重要的活性污泥法工艺之一，具有耗能低、脱氮效果良好、抗冲击负荷能力强等优点，其微生物群落结构动态主要受温度和进水水质等影响。孙豆豆通过对比5℃及10℃下AO工艺中的活性污泥，发现各微生物样品门、纲水平上差异较小，主要纲均为鞘脂杆菌纲和Betaproteobacteria纲，而嗜热丝菌门和脱铁杆菌门等只在5℃的样品中发现。蒙小俊等研究发现，AO工艺处理焦化废水时，其处理效果稳定期好氧段中优势菌门主要为Proteobacteria、Planctomycetes、Acidobacteria、Candidatus、Sacibacteria和Bacteroidetes等，并且Proteobacteria门占主导地位，其相对丰度比例为36.00%~76.98%。邹晓凤等发现在AO工艺处理煤化工废水时，好氧段中微生物的主要菌属为未分类菌属、Nitrospira、Nitrosospira、Azospira、Coxiella和Vampirovibrio等。

此外，在淀粉废水中，氨氮含量较高，碳氮比难以满足微生物正常代谢分解。利用AO工艺解读淀粉厂废水处理效能及微生物群落结构的研究，以及结合实际污水厂及实验室小试装置解读其运行过程中微生物差异性的研究均鲜有报道。基于此，本研究以河北某淀粉工业污水处理厂及实验室AO反应器为研究对象，通过调试AO工艺的运行参数优化水质处理效果;同时利用Miseq测序技术，解析污水厂及实验室AO反应器各阶段微生物群落动态变化;结合ANOVA分析方法，解读污水厂及实验室AO反应器微生物群落结构差异，为淀粉工业废水处理工艺的稳定运行提供技术支撑与理论依据。

1材料与方法

1.1污水站及反应器运行

污泥样品取自河北省某淀粉工业污水处理厂，该厂设计水量15000m3˙d−1，进水主要有3个来源：淀粉厂区废水、维生素B12厂区废水和企业内部生活污水。其中淀粉园区废水量9948m3˙d−1，维生素B12废水量5956m3˙d−1。该站主体工艺为多组改良型AO工艺，进水COD和NH4+-N平均浓度分别为500mg˙L−1和450mg˙L−1。污水站主要设计运行参数：污泥浓度3000mg˙L−1，混合液回流比50%，污泥回流比50%。共监测水质142d，其中第1～60天为前期调试阶段，第61～142天为后期稳定运行阶段。分别于污水厂调试开始时及氨氮去除率稳定在98%时，即第3天取污泥样品，编号为X1(缺氧段)和X2(好氧段)，第132天取污泥样品编号为Z1(缺氧段)和Z2(好氧段)。取样置于冰桶中运回实验室，离心(5min，11000r˙min−1)后称取5g冷冻于−80℃冰箱中，以备DNA提取。

AO反应器如图1所示，其采用有机玻璃制作，主体由进水桶(50L)，缺氧池(A池，1.8L)，好氧池(O池，5.4L)以及沉淀池和蠕动泵组成。接种污泥取自淀粉工业污水处理厂生化池，接种污泥浓度(MLSS)为3000mg˙L−1左右。污水厂污泥取回后，闷曝24h后排出上清液，去除原有污水中的有机成分，在AO工艺溶液体积不变的情况下缓慢进人工配水。为保证实验室AO装置与污水厂可比性，进水COD和氨氮平均浓度分别为500mg˙L−1和450mg˙L−1，人工配水组成：葡萄糖680mg˙L−1，氯化铵440mg˙L−1，磷酸二氢钾100mg˙L−1，七水合硫酸镁100mg˙L−1，七水合硫酸锌0.06mg˙L−1，氯化钙47mg˙L−1，硫酸亚铁40mg˙L−1，硫酸镁40mg˙L−1，并且需添加微量CoCl2˙6H2O和(NH4)6Mo7O24˙4H2O，以保证微生物生长所必需的微量元素[11]。

AO工艺进水及污泥回流均采用蠕动泵控制流量，进水流量初期控制为0.1L˙h−1，因装置反应体积较小，蠕动泵污泥及硝化液回流量较低，故适当提高回流比，使污泥和硝化液回流比分别为200%和100%，初期缺氧段和好氧段溶解氧浓度分别为0.1mg˙L−1和6.5mg˙L−1。水质监测共45d。在实际监测过程中，根据COD浓度变化投加碳源，在污泥驯化过程中及AO反应器脱氮效率稳定在85%时，水质不再发生明显变化，分别在第5天、第20天、第41天取污泥样品150mL，根据时间先后顺序编号W1、W2、W3，离心(5min，11000r˙min−1)后称取5g冷冻于−80℃冰箱中，以备DNA提取。

图1实验室AO反应器流程图

1.2DNA提取及PCR扩增

DNA提取采用PowerSoil®DNAIsolationKit试剂盒，按照试剂盒流程提取DNA。以所提取各样品DNA为模版，对其16SrDNAV4区扩增。反应体系为30μL，上游引物为EUb341f：5′-cctacgggaggcagcag-3′，下游引物为Eub907r：5′-ccgtcaattcctttgagttt-3′。PCR扩增管中添加DNA模板0.5μL，正反向引物各0.6μL，灭菌水22.4μL，dNTP2.4μL，3μL缓冲液，ExTaq酶0.5μL。PCR反应程序：先94℃预变性10min，然后进行30个循环(94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min。

扩增结束后，运用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，使用AxyprepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN)切胶回收DNA。PCR扩增后的条带亮度明显，位置清晰，可直接用于后续测序分析。委托北京理化分析测试中心进行IlluminaMiSeq高通量测序。

1.3高通量测序数据分析

本研究采用IlluminaMiSeqPE2×125测序方法进行测序。测序数据下机后，根据Barcode拆分不同样本数据，并去除Barcode序列及引物序列，利用FastQC对序列进行质量控制。使用FLASH(v1.2.7，ccb.jhu.edu/software/FLASH/)根据overlap拼接Miseq双端测序数据，拼接成功率控制在90%以上。利用QIIME(1.8，qiime.org/)过滤低质量序列，利用UCLUST(v1.2.22，http://www.drive5.com/uclust/downloads1_2_22q.html)对获得的高质量序列进行操作分类单元(OTU)划分，97%作为相似性阈值，并将获得的OTU与SILVA(Realease123，www.arb-silva.de)非冗余度0.9的16S序列数据库比对，获得各OTU代表序列的分类信息。基于OTU的聚类结果，使用QIIME(1.8，qiime.org/)软件计算各个样本α多样性，以反映本次测序深度、物种均匀性等，并根据注释结果，计算样本间距离矩阵，进行PCA可视化。利用ANOVA(analysisofvariance)方法计算污水厂与反应器中门和纲水平上物种注释的丰度差异情况。利用冗余分析(RDA)解析微生物与环境因子的相关性。实验设计原始数据上传NCBI网站，数据项目编号(BioSampleaccession)为SAMN08107549。

1.4常规水质指标测定

废水中常规指标检测方法为：COD采用微波消解法;氨氮采用纳氏试剂分光光度法(HJ535-2009);硝态氮采用麝香草酚分光光度法(GB/T5750.5-2006);亚硝态氮利用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(GB/T7493-1987);污泥浓度(MLSS)利用恒重法;pH采用PHB-2型pH计;DO采用LDO™便携式溶氧仪。

1.5统计分析

所得微生物群落结构数据利用SPSS19.0软件进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2结果与讨论

2.1水质处理效果分析

对污水厂和实验室反应器AO工艺处理系统进行水质指标监测，分别共计142d和45d，其对氨氮和COD处理效果分别如图2和图3所示。

图2污水厂氨氮和COD去除效果

图3实验室反应器氨氮和COD处理效果