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附录B
(规范性附录)
医疗废物消毒处理效果微生物检测程序和方法
B.1 医疗废物高温蒸汽消毒处理效果微生物检测程序和方法
B.1.1 检测材料
采用国家卫生健康委员会批准的生物内含式生物指示剂。生物指示剂为嗜热脂肪杆菌芽孢(B.s tearothermophilus ATCC 7953),含菌量为5×105-×106cfu/片。
B.1.2 检测方法
B.1.2.1 处理效果检测应采用符合《消毒技术规范》制作要求的嗜热脂肪杆菌芽孢生物指示剂,并在其有效保质期内。
B.1.2.2 将多个生物指示剂菌管随同医疗废物,放置于杀菌室内蒸汽处理效果最难保证的空间位置,或将菌管放置在包装盒内并裹挟进医疗废物中,在按照国家标准规定的灭菌参数下,进行消毒处理。
B.1.2.3 消毒处理完毕后,取出指示菌剂,捏碎玻璃管,按照产品规定的培养温度和培养时间进行培养(如无特殊说明,培养温度为56℃,培养时间为48h),同时以没有经历消毒处理的生物指示剂菌管做对照,并观察培养基颜色变化。试验重复3次。
B.1.3 消毒效果评价标准
以经过消毒的阴性菌管与阳性对照菌管的颜色变化相同与否判断是否到达消毒效果要求,阴阳对照菌管颜色变化相同或都不发生变化,说明消毒不合格;颜色变化不同,说明消毒合格。
B.2 医疗废物化学消毒处理效果微生物检测程序和方法
B.2.1 检测材料
B.2.1.1 实验菌株:枯草杆菌黑色变种芽孢(B.subtilis var.niger ATCC 9372)。
B.2.1.2 消毒因子:化学消毒剂。
B.2.1.3 中和剂:根据不同的化学消毒剂选择适宜的中和剂。
B.2.1.4 稀释液:胰蛋白胨生理盐水溶液。
B.2.1.5 培养基:胰蛋白胨大豆琼脂培养基、胰蛋白胨大豆培养基。
B.2.1.6 染菌载体:管长为2cm,内径为4mm的输液管。
B.2.1.7 模拟医疗废物的成分大致包括:5%的有机原料(如汉堡包、肉包子、馒头)和95%塑料、纤维素和玻璃等。模拟医疗废物的总投加重量应大于或等于实际应用中的最大负荷重量。
B.2.1.8 模拟杀菌因子:粉剂化学消毒剂(如石灰粉)可采用滑石粉;液体化学消毒剂(如次氯酸钠、二氧化氯等)可采用去离子水。
B.2.1.9 细菌培养计数所用器材,参考《消毒技术规范》。
B.2.2 检测方法
B.2.2.1 枯草杆菌黑色变种芽孢(B.subtilis var.niger ATCC 9372)的制备按照《消毒技术规范》相关方法制备枯草杆菌黑色变种芽孢(B.subtilis var.niger ATCC 9372)悬液。
B.2.2.2 染菌样本的制备方法
a)用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)配制成含芽孢悬液浓度为108-1010cfu/mL的TSB芽孢悬液。
b)将输液管放入装有芽孢悬液的容器中,搅拌,使其充分接触并浸泡5min后,将输液管放在消毒大搪瓷盘中,置于37℃恒温箱中烘干,制成染菌载体备用,使每克样本的回收芽孢数量在5×105-5×106cfu。
B.2.3 中和剂鉴定试验
按《消毒技术规范》中的方法进行中和剂鉴定试验。
B.2.4 处理效果检测实验
B.2.4.1 对照组操作步骤
a)处理过程:将一定数量染菌样本与待消毒的模拟医疗废物混合投加到预先已清洁过(未受到污染)的医疗废物处理设备中,并按设备操作说明书的剂量要求和方法,在最大负荷量(满载)的情况下,加入模拟杀菌因子作为对照组进行处理。
b)采样:医疗废物处理过程结束后,在设备出口排出的医疗废物残渣中收集一定数量的样品。
从收集样品中拣出染菌样本,取1g-2g,以无菌操作方式,用剪刀剪碎后加到装有20mL中和剂的离心管中,作用10min,将离心管用手振打200次,并做10倍系列稀释,选取适宜稀释度,分别吸取1mL,以倾注法接种于两个平皿中,做活菌培养计数。
B.2.4.2 实验组操作步骤
在最大负荷量(满载)的情况下,将模拟杀菌因子改为化学消毒剂,其余操作步骤包括采样过程均与对照组操作步骤相同。对照组和实验组试验均重复3遍。
B.2.4.3 阴性对照组操作步骤
试验结束后,将用过的同批次中和剂、洗脱液和稀释液接种培养基进行培养;另将未用过的同批次培养基放入恒温箱进行培养,作为阴性对照。
B.2.5 杀灭对数值的计算方法
每克样本菌落数:(A×B×C)/D
A为每平板平均菌落数;B为稀释度;C为样本洗液体积(mL);D为样本的重量(g);杀灭对数值(KL)=No-NxNo为对照组每克样本菌数的对数值;Nx为实验组每克样本菌数的对数值。
B.2.6 消毒效果评价标准
在3次试验中,对照组细菌芽孢数量应在5×105-5×106cfu/g,各次试验的杀灭对数值均≥4.00,阴性对照组均无菌生长,可判为消毒合格。
B.3 医疗废物微波消毒处理效果微生物检测程序和方法
B.3.1 检测材料
B.3.1.1 实验菌株:枯草杆菌黑色变种芽孢(B.subtilis var.niger ATCC 9372)或嗜热脂肪杆菌芽孢(B.stearothermophilus ATCC 7953)。
B.3.1.2 染菌载体:10mm×10mm 布片。
B.3.1.3 微波漏能检测仪(检测消毒仓室微波有无泄漏)。
B.3.1.4 培养基:胰蛋白胨大豆琼脂培养基。
B.3.1.5 洗脱液:胰蛋白胨生理盐水溶液。
B.3.1.6 细菌培养计数所用器材:参考《消毒技术规范》。
B.3.2 检测方法
按照《消毒技术规范》相关方法制备枯草杆菌黑色变种芽孢(B.subtilis var.niger ATCC 9372)和嗜热脂肪杆菌芽孢(B.stearothermophilus ATCC 7953)菌片。
B.3.3 处理效果检测实验操作步骤
B.3.3.1 按实际使用情况,在消毒室内模拟摆放常规处理的医疗废物至使用说明书中规定的最高装载量(满载)。将枯草杆菌黑色变种芽孢(B.subtilis var.niger ATCC 9372)或嗜热脂肪杆菌芽孢(B.stearothermophilus ATCC 7953)菌片放入消毒袋内,然后置于消毒仓室各层4个角、中央的医疗废物中间和消毒仓室最难消毒的部位。放入试验菌片前,按设备使用说明书要求的方法做预湿处理。
B.3.3.2 菌片布放完毕后,关闭消毒仓室门,按设备使用说明书的消毒程序进行消毒试验。消毒或消毒完毕后,打开消毒仓室门,以无菌操作方式试验菌片。
B.3.3.3 将试验菌片分别加到装有5mL洗脱液的试管中,用手振荡200次,做10倍系列稀释,选择适宜稀释度,分别吸取1mL,以倾注法接种于两个平皿中,做活菌培养计数,即为实验组。
B.3.3.4 试验时应同时设立阳性对照组(菌片对照)与阴性对照组(培养基对照)。阳性对照组:将同批试验用的菌片放在室温下,待实验组达到规定作用时间后,立即将该菌片2片分别移入含5.0mL洗脱液的2个试管中,用手各振荡200下,其余步骤与实验组相同。阴性对照组:分别取1mL所用洗脱液放于平皿内,加入15mL-20mL培养基,置于37℃培养箱48h,观察有无污染。试验重复3次。
B.3.4 杀灭对数值的计算方法
首先计算各组的活菌数(cfu/片),并换算为对数值(N),然后按下式计算杀灭对数值:杀灭对数值(KL)=No-NxNo为对照组平均活菌数的对数值;Nx为实验组活菌数对数值。
B.3.5 消毒效果评价标准
在3次消毒实验中,每次试验中的阳性对照菌片回收菌量均应达5×105-5×106cfu/片,阴性对照组应无菌生长,每次试验各点的杀灭对数值均≥4.00,可判为消毒合格。
B.4 医疗废物高温干热消毒处理效果微生物检测程序和方法
B.4.1 试剂和材料
生物指示剂:枯草杆菌黑色变种芽孢(B.subtilis var.niger ATCC 9372)。
B.4.2 仪器和设备
与生物指示剂相匹配的生物培养器。
B.4.3 样品
选择国际通用的高温干热消毒用生物内含式生物指示剂,枯草杆菌黑色变种芽孢(B.subtilis var.niger ATCC 9372),含菌量为5×105-5×106cfu/片。
B.4.4 分析步骤
B.4.4.1 将多个生物指示剂菌管随同医疗废物,放置于杀菌室内蒸汽处理效果最难保证的空间位置,或将菌管放置在包装盒内并裹挟进医疗废物中,在国家标准规定的灭菌参数下,进行消毒处理。
B.4.4.2 消毒处理完毕后,取出指示菌剂,捏碎玻璃管,按照产品规定的培养温度和培养时间进行培养(如无特殊说明,培养温度为56℃,培养时间为48h),同时以没有经历消毒处理的生物指示剂菌管做对照,并观察培养基颜色变化。
试验重复3次。
B.4.5 消毒效果评价标准
以经过消毒的阴性菌管与阳性对照菌管的颜色变化相同与否判断是否到达消毒效果要求,阴阳菌管颜色变化相同或都不发生变化,说明消毒不合格;颜色变化不同,说明消毒合格。
B.4.6 精密度和准确度
活菌计数因技术操作而引起的菌落数误差率(平板间、稀释度间)不超过10%。
B.4.7 质量保证和质量控制
在3次试验中,对照组细菌芽孢数量应在5×105-5×106cfu/g以上,阴性对照组均无菌生长,该实验结果可用。
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