固定化菌剂的制备及其对含油土壤的修复研究

摘 要：选取前期实验中从长庆油田措施废液集中处理后残渣中筛选的 3 株高效石油烃降解菌 D1、D2、 D5 作为研究对象，采用吸附法制备固定化菌剂，制备过程的最佳条件为：秸秆和草炭固定化菌剂的最佳固定 化时间均为 36 h，木炭的最佳固定化时间为 30 h；秸秆固定化菌剂和草炭固定化菌剂的最优载体加入量为 3.0 g/100 mL 菌悬液；木炭固定化菌剂的最优载体加入量为 2.0 g/100 mL 菌悬液。秸秆固定化的最佳 pH 为 7.0，草 炭和木炭固定化的最佳 pH 为 7.5；三种载体固定化菌剂的最佳固定化温度均为 35 ℃。在未灭菌的含油土壤 40 d 的室内原位模拟修复过程中，各固定化菌剂对石油烃的降解率大小依次为：草炭固定化菌剂 74.12%>木炭固 定化菌剂 70.25%>秸秆固定化菌剂 60.74%>游离混合菌 35.48%>不加菌对照 11.98%。在灭菌的含油土壤的修复过程中，几种处理方式对石油烃的降解率大小依次为：木炭固定化菌剂 70.75%>草炭固定化菌剂 69.90%>秸秆 固定化菌剂 68.28%>游离混合菌 44.30%>不加菌对照 2.21%。

关 键 词：固定化菌剂；微生物修复；复合菌群

含油土壤是指由于在油田采油及运输途中，由 于不正常的操作或其他事故等造成的落地原油与泥 土或其他杂质形成的含油固体废物[1]。针对含油土 壤的治理，国内外提出了较多的处理方法以及工艺 流程，但因含油土壤成分和性质较为复杂，每种治 理方法都存在一定的局限性。微生物降解技术因其 成本较低、操作简便、无二次污染、效果好等特点 而被广泛采用。石油是一种由各种烃类和非烃类物 质构成的复杂化合物。微生物对于烃类化合物的降 解有各自的局限性，通常单个菌株只能降解一定范 围内的石油烃，并且降解代谢过程往往是分步进行 的，复合菌群是由具有相互协同促进的多种菌株组 成的群体，利用不同菌株的协同作用，扩大底物的 范围，可以较好的提高石油烃的降解效率，则可形成一个完整高效的降解系统[2]。由于石油烃污染修复的降解菌大部分都是游离菌，降解过程中因为污染物的成分复杂，产生的一些次生代谢产物和中间 产物具有较大的毒性，而且很难被微生物所降解。 因此，固定化技术被逐渐引入土壤的修复中来[3]。 吸附法是一种比较简单的固定化方法，因其 具有固定操作简单、反应条件较温和、固定化成 本低等多重优点而被广泛应用于含油土壤和废水的治理 [4]。本文制备了三种固定化复合菌剂并对其性能进行了研究。

1 实验部分

1.1 试验材料

1.1.1 菌种来源

实验室前期从含油土壤中筛选出的的 3 株高效 石 油 烃 降 解 菌 株 ： D1 （ Bacillus sp. ） 、 D2 （Streptococcus sp.）和 D5（Alcaligenes sp.）。

1.1.2 培养基的制备

基础培养基为牛肉膏蛋白胨培养基和无机盐培 养基（NH4NO3 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 0.5 g， 无水 CaCl2 0.02 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，NaCl 5.0 g）。 在上述无机盐培养基中加入 0.5%原油即可得原油 液体培养基，再添加一定比例琼脂即可得原油固体 培养基。

1.1.3 试剂与仪器

石油醚、Na2HPO4、NH4Cl 和无水硫酸钠皆为 分析纯。紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器 有限责任公司）。

1.1.4 载体来源

秸秆：陕西省渭南市某县收集；木炭：购置于 广州科骆尔生物能源科技有限公司；草炭：购置于 辽宁清原泥炭土加工厂。以上载体经通风阴干后用 粉碎机粉碎，过 80 目筛，备用。

1.2 实验方法

1.2.1 固定化复合菌剂的制备

将 3 株单菌的菌悬液分别按照正交优化条件下 的最佳的接种比例混合即可制得混合菌悬液；分别 称取 2.0 g 的三种载体，加入到装有 100 mL 牛肉膏 蛋白胨培养基的 250 mL 锥形瓶中，121 ℃高压灭菌 20 min。接入 6 mL 混合菌悬液，150 r/min，30 ℃ 恒温摇床震荡培养 36 h 后，用双层纱布进行过滤， 并用灭菌的生理盐水进行洗涤 2~3 次，即可得固定 化复合菌剂[5]。

1.2.2 原油降解率的测定

原油降解率的测定采用超声萃取-紫外分光光 度法进行测定。在无菌条件下，接入固定化的复合菌剂至装有 100 mL 灭菌的原油液体培养基中，30 ℃、150 r/min 恒温摇床震荡培养 7 d 后，加入 25 mL 石油醚，超声波萃取其中的石油，此步骤重复 3 次， 将上层液合并转至分液漏斗，收集上层萃取液，过 滤后进行定容，以石油醚作为空白参比，测定 OD 值，计算含油率，与初始的含油量作对比，计算原 油降解率[6]。

1.2.3 固定化菌剂与载体、载体-菌液混合物的降解对比实验

首先准备 10 组已灭菌的 100 mL 原油液体培养 基，在其中分别加入 6 mL 混合菌液、2.0 g 载体（3 种）、2.0 g 载体（3 种）与 6 mL 混合菌液的混合 物、2.0 g 载体固定化菌剂（3 种），150 r/min，30 ℃ 恒温摇床震荡培养 5 d，测定原油降解率。

1.2.4 最佳固定化时间的确定

称取 2.0 g 三种载体，接入 6 mL 混合菌液之后， 150 r/min,30 ℃恒温摇床震荡培养 18、24、30、36、 42、48 h 后，制得固定化菌剂，将其加入 100 mL 原 油液体培养集中，30 ℃，150 r/min 水浴摇床震荡培 养 5 d，测定原油的降解率，以判断最佳固定化时间。

1.2.5 最佳固定化载体的量的确定

分别称取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g 载体，接入 6 mL 混合菌液，150 r/min，30 ℃恒温培养 36 h， 得固定化菌剂。加入 100 mL 原油液体培养基，150 r/min，30 ℃恒温培养 5 d，测定原油的降解率。

1.2.6 最佳固定化

pH 的确定 2.0 g 载体，接入 6 mL 混合菌液之后， pH 调 为 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，150 r/min，30 ℃恒温 培养 18、24、30、36、42、48 h，制得固定化菌剂。 将其加入 100 mL 原油液体培养基中，30 ℃，150 r/min 水浴摇床震荡培养 5 d，测定原油的降解率。

1.2.7 最佳固定化温度的确定

称取 2.0 g 三种载体，接入 6 mL 混合菌液之后, 分别置于不同温度恒温摇床中培养 36 h 后，制得固 定化菌剂，将其加入 100 mL 原油液体培养集中， 30 ℃，150 r/min 水浴摇床震荡培养 5 d，测定原油 的降解率。

1.2.8 固定化复合菌剂对含油土壤的修复

将配置好的5%的原油浓度的供试土壤200 g放 入 100 mL 烧杯中。在含油土壤中加入 10%的各种 固定化复合菌剂，每个处理设 3 个平行对比实验。 含油土壤分为灭菌组和未灭菌组不同处理。30 ℃培 养 40 d，每 2 d 补加无菌水，使其含水率保持在 35% 左右，每天翻动土壤。分别在 0、5、10、15、20、 25、30、35、40 d，四分法取样测定原油降解率。

1.2.9 土壤中石油烃含量的测定

将降解后的含油土壤风干后磨碎，称取 2.0 g 试样置于 50 mL 比色管中，加入 25 mL 石油醚超声 15 min，过滤收集滤液至 50 mL 烧杯中，再加入 20 mL 石油醚进行超声波提取，合并提取液至 100 mL 容量瓶中，紫外测定含油浓度。降解率计算如下：

2 结果与讨论

2.1 固定化菌剂与载体、载体-菌液混合物的降解效果的对比

由图 1 可以看出，降解率最高的是草炭固定化 菌剂，达到了 92.02%，再依次是木炭固定化菌剂和 秸秆固定化菌剂，降解率分别为 89.28%和 85.25%， 均高于单独投加载体和载体-菌液混和物的降解率。

2.2 最佳固定化时间的确定

不同固定化时间制得的固定化菌剂，原油降解 效果如图 2 所示。 由图 2 可以看出，三种载体固定化菌剂的原油 降解率均呈先升高再下降的趋势。秸秆和草炭固定 化菌剂的最佳固定化时间均为 36 h，原油降解率最 高达到了 87.46%和 87.07%；木炭的最佳固定化时 间为 30 h，原油降解率为 83.89%。