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对于C18柱测试有效塔板数,我们规定使用5mg/ml萘,作为测试品,以甲醇:纯水=70:30(v/v),检测波长为254nm,流速1.0ml/min。有了这些条件,我们再测试下死时间(上述空管+甲醇测死时间),我们就可以计算有效塔板数了。
对于W1/2h如何测试,一般的色谱工作站都会给出每个色谱峰的半峰宽,我们找抄即可。
这里给出一个例题,测试色谱柱的有效塔板数(Neff)
用测试萘的色谱条件测试色谱柱的有效塔板数,有四根色谱柱,
我们可以看到,同样长度的色谱柱,颗粒度越小,其有效塔板数越多。这个如何理解呢?颗粒度越小,那么填料在单位体积内的数量越多,保留效率越高,所以,保留时间比颗粒度小的同样规格的色谱柱要长,这也说明,如果长度,填料内径相同的条件下,其分离效果越高。
相同填料粒径和内径的色谱柱,如果长度越长,填料一般来说越多,保留时间长证明了其保留能力强,这样体现在色谱柱有效塔板数比相同规格的略短的色谱柱多。
有时候使用相同的色谱柱,在用了一段时间后,相同浓度的相同条件下,色谱峰变宽,微观角度来解释,就是色谱柱填料流失。使得色谱柱中填料数目减少,使得色谱柱颗粒间间隙宽。物质在色谱柱里走的路径多了,所以色谱柱展宽。这样子就证明色谱柱性能下降。如果色谱柱性能降到不能有效分离物质,那么这根色谱柱寿终正寝了。
对于C18柱,一般是用甲苯,联苯,萘等物质配成混合物,以5mg/ml萘计算有效塔板数。色谱柱一般需要3个月或半年测定一次有效塔板数。现在色谱工作站有计算有效塔板数的功能,一般我们只要填入t0死时间,就可以计算色谱柱的有效塔板数了。在15年前或者更在,色谱工作者们是通过三角尺和色谱图量的方法计算有效塔板数的。当时确实条件艰苦,但是这样操作,能够实时看到色谱柱使用过程中“牺牲”自我的一个历程。
2.拖尾因子(tailingfactor)
对于拖尾因子,根据中国药典,拖尾因子是指:
从图中,我们可以看到,W0.05h指5%峰高处的峰宽,以峰顶点做垂线到5%峰宽,分为两份,其中前一份为d1,假如前半峰d1=后半峰,则拖尾因子为1.00.也就是前后半峰5%处宽度相等,说明峰对称。如果前半峰d1小于后半峰,则Tailingfactor大于1,则峰后拖尾,反之是前拖。
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