菌糠强化微生物降解石油污染土壤修复研究

摘要：采用菌糠协同高效石油烃降解菌 Microbacterium.sp.Q2 进行石油污染土壤修复试验研究，分别设置菌糠固定化微生物组(SIM)、菌糠-游离菌组 (SMSB)、菌糠单独组(SMS)和对照组(CK)4 组修复实验。考察不同处理方式下对石油污染土壤微生物数量、酶活性和石油烃降解效果的差异性并确定 石油污染土壤的最佳修复方案。结果表明:不同修复方式下,SIM 组的土壤呼吸强度、微生物数量及酶活性较其他组有明显提高,其对石油烃去除率分别 比其他 3 组提高 11.84%、22.15%、54.09%。土壤中脱氢酶活性以及微生物活性与石油烃降解率的相关性显著，此外菌糠固定化微生物对石油污染土壤修复具有生物强化和生物刺激协同的作用机制。

关键词：菌糠；固定化微生物；土壤修复；石油烃降解

近年来,石油行业得到了蓬勃的发展,在对石油 的勘探、开发、储运与加工及使用过程中,原油和原 油制品跑、冒、滴、漏等造成采油区和炼厂附近大 面积土壤污染[1]。固定化微生物技术克服了传统方法修复过程中的缺点[2],不仅可以提高菌密度，还有利于屏蔽环境的毒害作用,增强外源菌竞争优势,提 高降解效率,在石油污染土壤治理领域中应用越来 越广泛[3 4]。

菌糠是收获食用菌后废弃的培养基质,据统计 每出产 1kg 食用菌约产生 5kg 菌糠,每年约有 8000 多万 t 废弃菌糠通过焚烧、填埋等方式处理,不仅占用了大量土地,燃烧过程中还会产生甲烷等温室气 体或有毒化合物(如二噁英)等。研究发现菌糠中富含 有机质、钾、钙、镁、氮、磷以及铜、锌、铁等多 种营养元素，加工处理后可用于作物肥料和土壤调理剂[5]，同时其结构疏松多孔，表面较粗糙，含有较多官能团和真菌菌丝体，能够分泌漆酶、锰过氧化物酶 等,可以吸附染料、重金属、石油烃等多种污染物质[6],改善土壤肥力。

目前，对于农业废弃物的资源化利用，将其作为载体材料固定化微生物，在修复有机污染物方面取得了一定成效[7 8]，但由于其只具备单一的吸附性能， 降解有机物能力相对较弱。而菌糠不仅可以作为微生物载体，又可以通过细菌-真菌-酶体系强化降解有机污染物[9 10]，发挥双向优势，提高污染物去除效率，因此探究菌糠的综合资源化利用方式处理环境污染问题值得探讨。

将菌糠与高效石油烃降解菌结合，通过花盆实验模拟菌糠固定化微生物、菌糠-游离菌以及菌糠单独添加对石油污染土壤原位修复，探究修复过程 中对土壤呼吸强度、微生物数量、微生物区系以及 土壤生态毒性的影响差异，确定最优修复方式，为菌糠修复石油污染土壤的应用提供一定的技术支撑 和理论依据。

1.实验部分

1.1 实验材料

实验土样取自胜利油田 0~20cm 附近石油污染土壤,将土样压碎翻动至松散，风干后过筛，取 40~80 目之间的土壤，即去除较大杂质和直径过小的细土， 筛分后的土壤于-20℃低温冷冻保存。

新鲜菌糠选自山东青岛天农食用菌有限公司， 初始湿重 15%，过 40 目筛于-20℃低温冷冻保存。

1.2 实验菌株

实验菌株 Q2 是以胜利油田污染土壤为菌源，胜利原油为唯一碳源筛选驯化所得土著菌，经 16S rDNA 生物分子学鉴定为 Microbacterium sp.Q2，在原油质量浓度为 1000mg/L 的无机盐培养基中，微杆 菌 Q2 在 7d 内对石油烃降解率为 45.52%。

1.3 修复实验设计

采用盆栽(pot experiment)模拟实验进行石油污 染土壤修复研究。用磷酸二氢钾和硝酸钠调节土壤 C、N、P 的质量比为ω(C):ω(N):ω(P)=100:10:1，修复过程中可直接采用减重法调节各个花盆中的含水 率,使之保持在 18%左右[11]。

试验分 4 组，每组 3 个平行，共 12 盆，每盆分别加 入 500g 质量分数为 4.57%石油污染土壤，分别加入 菌糠(SMSB)、菌糠-游离菌(SMS)、菌糠固定化微 生物(SIM)，其中一组为空白对照组(CK)，将 3 个处理 组样品放于 30℃、60% RH(Relative huity,空气相 对湿度)的恒温恒湿培养箱中，每天光照 10h，修复过 程中每隔 7d 采样测定各花盆中石油烃含量，土壤呼 吸强度、微生物数量及土壤酶活性等指标,试验周期 为 45d。

1.4 土壤呼吸强度及微生物数量的测定

土壤呼吸强度采用碱液吸收法测定，称取10g新鲜土壤于 200mL 烧杯中，其中插入含有 5mLNaOH(2mol/L)溶液的小烧杯,置于 30℃下密封 培养 24h，将溶液转移至容量瓶中定容，分别以酚酞 和甲基橙为指示剂，用 0.1mol/L HCl 溶液滴定，根据 消耗量计算出土壤呼吸产生 CO2 [mg/(kg⋅h)]的量。

采用稀释平板计数法测定微生物数量， 称取 5g 土壤于盛有 100mL 无菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振 荡后进行逐级稀释于培养基中涂布，牛肉膏蛋白胨固体培养基用于计数细菌数量，孟加拉红培养基用 于计数真菌数量。将涂布好的培养基置于 30±2.0℃ 恒温培养箱中培养 5d 后计数。

采用 DNA 提取-PCR 扩增-DGGE 电泳的分子 生物学方法，在修复的第 7d、第 21d 和第 45d，分别 采集 4 组盆栽中的土样,提取其总 DNA，对 16SrDNA 的V3可变区进行PCR扩增，扩增产物由变形梯度凝 胶电泳(DGGE)进行检测，研究土壤的微生物区系动 态变化。

1.5 土壤生理生化参数及生态毒性测定

土壤中漆酶活性测定采用 ABTS-紫外分光光 度法，以柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH=4.5)，于 420nm 波长下测定吸光度;锰过氧化物酶活性采用 愈创木酚-紫外分光光度法，以磷酸为缓冲液(pH= 7.0)，于 470nm 波长下测定吸光度，定义吸光度每分 钟变化 0.01 为一个酶活单位(U)。

储存在活细胞中的荧光素二乙酸酯(FDA)能够 被细菌以及酯酶等非专一性酶类水解，释放出荧光素，因此 FDA 水解酶能够较好反映土壤微生物活性 以及土壤质量的变化[12]。脱氢酶是微生物呼吸过程 中分泌的胞内酶[13]，它们与微生物种群密切相关，对 环境扰动非常敏感.因此,考察这两个指标不仅可以 表征土壤的生态毒性,还能从侧面反应污染物的降 解效果。

其中 FDA 水解酶以荧光素二乙酸酯为底物，采 用分光光度法于 490nm 处测定吸光度;脱氢酶活性 采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)还原法于 485nm 处 测定吸光度数值来表示酶活性大小。

1.6 土壤石油烃含量的测定

土壤中石油烃含量采用超声-索氏萃取-重量 法测定。具体步骤为准确称取 5.00g 土样于离心管中， 以二氯甲烷为萃取剂,振荡,超声萃取 15min，重复 3 次，萃取结束后离心分离，将上清液倒入烧瓶，于 54℃ 旋转蒸发至干且恒重，烧瓶前后质量差即为石油烃含量。

1.7 土壤石油烃降解动力学方程

一级动力学方程，土壤剩余石油烃含量时间变 化动力学模型回归方程为:

v> 式中：C0 为初始石油烃含量；C 为时间 t 下石油烃含 量； t 为修复时间；k 为微生物降解速率常数。

1.8 数据统计分析

实验所得数据采用Excel 2010和origin 9.0进行处理和制图，采用 SPSS 22.0 软件进行主成分分析。