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6 仪器和设备
除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的A级玻璃器皿。
6.1 固相萃取装置：自动或手动，流速可调节。
6.2 浓缩装置：自动氮吹浓缩仪或K-D浓缩器等性能相当的设备。
6.3 液相色谱/串联质谱仪：配有电喷雾离子化源(ESI)。
6.4 色谱柱：C18或等效反相高效液相色谱柱，参考规格为：50 mm(长度)×4.6mm(内径)，1.8 µm(填料内径)。
6.5 样品瓶：1000 ml带聚四氟乙烯内衬垫瓶盖的棕色玻璃瓶。
6.6 微量注射器：10 μl、20 μl、50 μl、100 μl、250 μl。
6.7 一般实验室常用仪器和设备。
7 样品
7.1 样品的采集
参照HJ/T91和HJ/T164的相关规定采集样品。
用预先洗涤干净并干燥的磨口棕色玻璃瓶采集水样，样品采集时应充满样品瓶(6.5)，不留空隙。
7.2 样品保存
水样于现场立即添加盐酸溶液(5.8)调节样品pH为2.0～4.0左右，并加入150 mg抗坏血酸(5.7)及0.25 g EDTA(5.6)，在0℃~4℃冷藏避光保存，7天内分析完毕。
7.3 试样制备
7.3.1 样品预处理
样品采用固相萃取法富集前，水样采用孔径为0.7 μm的玻璃纤维膜(5.22)过滤。
7.3.2 固相萃取法
分别用5 ml 甲醇(5.4)、5 ml去离子水、5 ml pH=2.0去离子水(5.10)活化固相萃取柱(5.21)，保证小柱柱头浸润。量取500 ml水样，加入25.0 μl替代物使用液(5.20)，采用盐酸溶液(5.8)调节水样pH为2.0～4.0左右，水样以10~15 ml/min的流速通过小柱。用去离子水淋洗小柱，去除小柱上的EDTA。之后用氮气(5.24)吹扫、干燥小柱。再用10 ml甲醇(5.4)以5 ml/min的流速洗脱小柱，洗脱液接收于收集管中。洗脱液经氮吹(5.24，注意保持液面微微波动)浓缩至0.5 ml左右，加入内标使用液(5.19)25 μl，用稀释溶剂(5.14)定容到1.0 ml，过0.22 μm有机滤膜后待测。
7.4 空白试样制备
7.4.1 以实验用水代替样品，按照水样处理(7.3)相同操作步骤，制备固相萃取法空白试样。
8 分析步骤
8.1 仪器参考条件
8.1.1 液相色谱参考条件
流动相：0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液(5.13，A相)，0.1%甲酸去离子水溶液(5.11，B相)。梯度洗脱程序见附录B。
流速：0.3 ml/min。
柱温：40 ℃。
进样体积：20 μl。
8.1.2 质谱参考条件
离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式。
毛细管电压：4000 V，干燥气体温度：350℃，雾化器压力：35 psi
干燥气体流速：10 L/min。
多离子反应监测方式(MRM)，具体条件参见附录C。对于不同质谱仪器，参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。
8.1.3 仪器调谐
按照仪器使用说明书在规定时间和频次内对液相色谱/串联质谱仪进行仪器质量轴和分辨率调谐校正，以确保仪器处于最佳测试状态。
在仪器使用过程中，如发现仪器质量数出现明显偏差或灵敏度大幅度下降时，应立即重新对仪器进行质量轴和分辨率调谐。
8.2 校准
8.2.1 校准曲线的绘制
取一定量抗生素类化合物标准使用液(5.16)、内标物(5.19)及替代物使用液(5.20)于2 ml进样小瓶中，制备不含原点的标准系列(至少5个浓度点)，使抗生素类化合物及替代物的质量浓度分别为2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100 μg/L和200 μg/L(参考浓度)，内标的质量浓度为50 μg/L(参考浓度)。
由低浓度到高浓度依次对标准系列溶液进样，以标准系列溶液中目标组分的浓度为横坐标，以其对应的峰面积(或峰高)与内标物峰面积(或峰高)的比值和内标物浓度的乘积为纵坐标，建立校准曲线。线性回归方程、线性范围和相关系数详见附录。
y=ax+b (1)
式中：x-目标组分浓度，μg/L
y-目标组分和内标物的峰面积(或峰高)比值与内标物浓度的乘积
a- 校准曲线斜率
b- 校准曲线截距
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