1977-1999 | 厌氧氨氧化前20年的故事

今年劳动节，小编跑去荷兰的代尔夫特度假了。既然来到代尔夫特，必然要去欧洲的麻省理工——代尔夫特理工大学(TU Delft)，顺便拜访一些朋友。接着访友之便，我去了他们的环境系瞅了一眼，既看到了著名的Mark van Loosdrecht教授在TNW新大楼授课的英姿，也学习了一下污水处理最前沿的研究课题。

荷兰代尔夫特大学环境技术组 | 版权：瓦村农夫

谈到TU Delft在环境领域的研究，必然会谈到厌氧氨氧化和好氧颗粒污泥两大工艺。回国途中，我特地在微信搜了“厌氧氨氧化”这个关键词，发现好几篇叙述它发展历史的文章似乎都有些错误。20年前的今天，即1999年7月29日，一个关于厌氧氨氧化的重大发现了登上了Nature。借着这个巧合的日子，小编将在本期的《第三眼》专栏里，重新整理一下厌氧氨氧化菌前20多年的研究发展史。

厌氧氨氧化研究史的前20年

Gist-Brocades(简称GB公司)，1967年成立于荷兰的代尔夫特。它是一家生物技术公司，主要产品包括青霉素、酵母、酶(gist在荷兰语是酵母的意思）。这家公司在荷兰/世界污水处理史上有着很特别的分量，甚至可以独立成章：1978年，瓦赫宁根大学的Gatze Lettinga教授做出的第一个UASB系统(800m³)是为CSM (Centrale Suiker Maatschappij，荷兰一家甜菜制糖公司)设计的，但后来CSM受到德国的一个项目的拖累，导致1984年被Gist-Brocades收购了，从此这家并非靠环保赚钱的公司同时有了厌氧颗粒污泥和厌氧氨氧化的交集。但好景不长，GB公司后来又将EGSB工艺技术卖给美国的Biothane， 到了1998年GB公司自己也难逃被收购的命运，以13亿美金的天价被帝斯曼集团(DSM)收了。

说个题外话，GB公司在代尔夫特可没少收到当地市民的投诉和抱怨，因为工厂产生的富含硫化氢臭鸡蛋味的废水废气让周边居民痛苦不已。这些企业在上世纪7、80年代也有许多不光彩的过去。荷兰的生物技术公司也是经过多年的品牌经营，才逐渐洗白了“污染大户”的恶名，并逐渐树立了高科技环保绿色科技公司的形象。因此，我们应该对自己的民企有信心。

荷兰在污水处理有今天的领先地位，可能还真得感谢当年那些投诉过GB公司的热心市民。可能连他们自己都不知道，正是他们督促了GB公司的环境治理，最终促成了厌氧氨氧化菌的伟大发现：为了解决跟周围居民的问题，上世纪80年代中期GB公司引进了一套无臭的中试设备，应用厌氧技术实现反硝化脱硫，污水臭气问题得以解决。

对外的臭气问题解决了，GB公司的运行人员却发现了处理系统的一个奇怪现象——在中试运行几个月后，反硝化反应池氨氮浓度下降了，硝酸盐也减少的，还观察到明显的氮气产出。“书里不是说氨氮只能在好氧条件发生转化吗？反硝化池的氨氮浓度应该保持不变才对啊？”当时在GB公司担任循环创新研究员的Arnold Mulder对此十分不解。他将此现象汇报给他的上司，上司很快就找到TU Delft的Gijs Kuenen教授进行咨询。

10年前的一篇论文

如果有人邀请小编给厌氧氨氧化污水处理的工艺发展史作传，那么Arnold Mulder和Kuenen教授的见面一定是这个故事的开头。

1940年12月9日，Gijs Kuenen出生于阿姆斯特丹西边的小城Heemstede。1972年，Kuenen教授在格罗宁根大学获得微生物学博士学位。毕业辗转洛杉矶和格罗宁根几年之后，在1980年他又回到代尔夫特，成为TU Delft第四任的微生物教授。前三人都是代尔夫特理工的传奇人物，包括Martinus Beijerinck、Albert Kluyver和Cornelis van Niel。

除了当教授，当时Kuenen每周会抽几小时给GB当咨询顾问的。GB公司请他给公司那套新的废水处理系统的硫循环做技术指导。当被告知氨氮的离奇失踪时，Kuenen想起了10年前他看过的一篇论文：1977年，当时67岁的奥地利理论化学家Engelbert Broda发表了一篇文章，题为“Two kinds of lithotrophs missing in Nature（原题为德语Zeitsift für allgemeine Mikrobiologie）”。这篇文章在当时学术圈可谓一声惊雷，当时37岁的Kuenen也拜读了这篇文章，并和他的实验室同事就此展开讨论，但他们大都认为氨是不可能在厌氧条件下被氧化的…

和Arnold Mulder的交谈唤起了Kuenen教授尘封了10年的记忆，他告诉Mulder：“我10年前就看过一篇paper报道过这个现象。” 就这样，他们开始了紧密的合作(注：Arnold从未入读博士)。Arnold也给这个潜在工艺起了一个很朗朗上口的缩写名称——ANAMMOX（厌氧氨氧化）。然而，Arnold“简单粗暴”的尝试并不成功：他无法通过培养富集出促成这个反应发生的微生物，因此无法确定这是一个自发的化学反应，还是一个生物反应。

Kuenen此时又想起了奥地利人列出的两条热力学成立的化学方程式：

他跟Arnold提议，不如我们用15-N同位素示踪技术来确认氮气的来源，看它是不是来自氨氮。Kuenen教授将这个重任委派了他手下的一位女硕士研究生，Astrid van de Graaf。Astrid在实验室用流化床反应器做实验，成功发现了14,15-N2。这个发现固然让人激动万分，但他们还需要更多的证据来充分印证这个反应的生物属性。幸运的是，Kuenen教授向荷兰技术基金会（STW）申请到资金为Astrid专门开设一个博士项目，确保后者可以安心将研究进行下去。

Astrid在Lesley Robertson(从1974就在TU Delft担任实验室研究员)的帮助下，设计了一系列实验来证明这个生物反应的存在，并富集反应的微生物。通过15-N示踪标记亚硝酸盐、硝酸盐和羟胺等含氮物，她识别出各种中间物和反应产物。中间少不了各种热处理、伽马射线处理以及最优温度分析等大量苦力活。皇天也不负有心人，他们最终成功验证了这个生物工艺的存在，而且基本可以确认：anammox富集物的基质是亚硝酸盐，而不是硝酸盐。

1999年的那篇报道

Astrid在1997年完成了她的博士学位，这时候一个叫Marc Strous的博士生拿过她的交接棒。研究团队交给他有一个新的挑战——对anammox菌进行富集提纯。利用SBR反应器，Marc成功地可重复地培养高产量的anammox菌，纯度高达70％。

有了高纯度的微生物，Kuenen教授的团队就可以做更多分析了。他找到澳洲昆士兰大学的John Fuerst教授和他的同事帮忙确认目标微生物。借助电子显微镜的近距离观察，他们发现这些这些细胞有一个奇怪的、靠膜隔开的内室。这可是一个大惊喜！要知道，只有更复杂(真核）细胞才有这种隔室，就像人类细胞拥有的那些细胞器（organelles）。这些细胞器负责执行特定的生物学功能，对细胞组分、代谢过程和信号传导途径起时空控制作用。简单的原核细胞和细菌都没有细胞器。目前科学家只知道浮霉菌（Planctomycetes）具有这种结构，因此研究团队推断anammox菌属于该门。

话说浮霉菌非常奇特，因为它同时含有细菌、真菌和古菌三大菌属的特性，因此有些人认为该菌在早期可能跟三大菌属是同一个祖先。只是DNA的研究将它们归在了细菌数一类。可以说，浮霉菌的出现模糊了细菌的定义。

在此之前，没有人将浮霉菌门跟厌氧氨氧化拉上关系，但Kuenen教授的团队用氨氮和亚硝态氮培养出了这种细胞，底物也随反应过程消失。基因分析也进一步证实了这些微生物的分类，他们将它取名Brocadia anammoxidans：anammoxidans表示其独特的生化特性，Brocadia既表示了这些细菌的发现地（Delft的Brocades），另外也因为这些鲜红色的细菌让研究者联想到明艳的织锦。

Marc Strous作为一作的那篇题为“Missing lithotroph identified as new planctomycete”的文章登上了Nature，时间正好是20年前的今天——1999年7月29号。这篇文章几乎是一夜间改变了学术界对anammox菌的“偏见”。从此，“anammox”成了学术界争相研究的热点。

研究需要时间

话说在6月份，为了搜集资料，我亲自跟Kuenen教授发过邮件提问。其中我问他GB公司的管理层是否给予了Arnold Mulder和Kuenen教授团队足够的支持。

我将他的答复简单翻译一下：“GB给了Arnold和我们5年的时间。Astrid五年的博士论文都在做跟其相关的研究。15-N重氮示踪法实验就是Astrid和GB公司的一个15N专家一起做的。GB公司对我们的合作态度一直很积极，这几乎贯穿了我在TU Delft的生涯。我TU Delft的同事也有不少跟GB的积极合作，例如抗生素的研发等。”

1977到1987，再到1999年，这20多年里学术界对厌氧氨氧化认知的变化，就是我今天想跟读者们分享的故事。这是一个关于时间和耐心的故事。22年，说长不长，说短不短。但对于1972年博士毕业、2005年退休的Gijs Kuenen教授来说，厌氧氨氧化几乎贯穿了他在代尔夫特的整个科研生涯。虽然硫氧化菌才是Kuenen教授的挚爱，但最后用他名字命名的却是厌氧氨氧化菌的一个属Kuenenia。